Charakterisierung von Methyltransferasen mithilfe molekularer Sonden am Beispiel des Enzyms Set7/9
Jung, Britta - Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen (2016)
Viele zelluläre Prozesse werden über kovalente Modifikationen von DNA und Proteinen reguliert. Verschiedene Enzyme erkennen die Modifikationen und leiten zelluläre Reaktionen ein. Eine wichtige Modifikation ist die Methylierung, bei der die Methylgruppe des Cofaktors S Adenosyl-L-methionin (AdoMet) mithilfe von Methyltransferasen (MTasen) sequenzspezifisch auf DNA oder Proteine übertragen wird.
Zur Charakterisierung der MTasen wurden in dieser Arbeit Methoden entwickelt, die auf dem Einsatz molekularer Sonden beruhen. In einem zweistufigen Verfahren zur Markierung von Protein-MTase-Substraten kommen AdoMet-Analoga zum Einsatz, die statt der Methylgruppe eine verlängerte, funktionalisierte Seitenkette tragen. Diese wird in einer ersten, enzymatischen Reaktion sequenzspezifisch auf Proteine übertragen und in einer zweiten, chemischen Reaktion kovalent mit einem Reporter, z. B. einem Fluorophor, verknüpft. Die enzymatische Übertragung der Seitenkette erfolgt durch einen engen Bindungstunnel. Um einer sterischen Hinderung entgegenzuwirken, wurde in dieser Arbeit eine Variante des Enzyms Set7/9 durch Austausch der Aminosäure Tyrosin 305 durch Leucin hergestellt. Diese Variante besitzt einen erweiterten Bindungstunnel und weist dadurch eine deutlich erhöhte Aktivität mit den Cofaktoranaloga im Vergleich zum Wildtyp auf. Um die Bindung der Analoga weiter zu verbessern, wurde die MTase von enzymgebundenem natürlichem Cofaktor AdoMet befreit. Desweiteren wurde eine neue Methode entwickelt, um überschüssigen Fluorophor zu entfernen, der die Detektion mittels Gelelektrophorese stören würde. Neben einer deutlichen Aktivitätssteigerung wurde die Reaktionsdauer der Modifikation von 2 h auf 5 min reduziert und die mindestens benötigte Cofaktorkonzentration im Fall von dem AdoMet-Analog SeAdoPropin von 600 µM auf 10 µM herabgesetzt. Die hohe Sequenzspezifität der MTase blieb dabei erhalten. Vollständiger Umsatz wurde mit 10 µM MTase (Set7/9-Variante), 10 µM Substrat (Histon H3) und 100 µM Ado-Met-Analog (SeAdoPropin) erzielt.
Für die zweite, chemische Reaktion wurde in dieser Arbeit eine spannungsinduzierte Variante der kupferkatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC), die SPAAC, unter Verwendung gespannter Cycloalkine getestet. Im Gegensatz zur CuAAC kommt die SPAAC ohne cytotoxisches Kupfer aus. Mit den verwendeten Cycloalkinen wurden allerdings unspezifische Nebenreaktionen festgestellt. Mit dem Ziel einer Substratanalyse wurde das zweistufige Markierungsverfahren auf Proteinarrays angewendet. Die zuvor beschriebene Verbesserung des Verfahrens sowie die Optimierung eines bestehenden Protokolls zur Durchführung auf Arrays, führten zu einer deutlichen Reduzierung eines starken unspezifischen Hintergrundsignals auf den Arrays. Zur Analyse der Cofaktorbindung verschiedener MTasen wurden fluoreszierende Cofaktoranaloga synthetisiert. Über eine Fluoreszenzänderung bei der Bindung der Analoga im Enzym wurden die Bindungsaffinitäten ermittelt. Mithilfe verschiedener Cofaktoranaloga mit unter-schiedlich positioniertem Fluorophor wurden die MTasen auf sterische Gegebenheiten der Cofaktorbindung hin untersucht. Zusätzlich wurden in kompetitiven Tests die Bindungsaffinitäten verschiedener MTasen zu dem natürlichen Cofaktor AdoMet, dem Cofaktorprodukt S Adenosyl-L-homocystein (AdoHcy) sowie dem Cofaktoranalogon SeAdoPropin bestimmt. Dabei wurden gravierende Unterschiede in der Cofaktorbindung der untersuchten MTasen festgestellt.