Entwicklung von HPLC-MS/MS-Methoden zum Nachweis von proteinbasierten Bindungssystemen in Fleisch und Fleischerzeugnissen
Jira, Wolfgang - Technische Universität Berlin (2017)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden auf Basis der Kopplung von Hochleistungsflüssigchromatographie und Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS) basierende Methoden zum Nachweis des Einsatzes der marktrelevanten proteinbasierten Bindungssysteme mikrobielle Transglutaminase (TG) und Fibrinogen/Thrombin (FT) von Rind und Schwein bei Fleisch und rohen Fleischerzeugnissen entwickelt.
Für die Erarbeitung einer HPLC-MS/MS-Methode zum Nachweis von TG in restrukturiertem Fleisch (Schwein, Rind, Huhn und Pute) wurden Versuche zur proteinbasierten Bindung mit zwei technischen TG-Mischungen mit und ohne Caseinat durchgeführt. Nach der Ermittlung von sechs charakteristischen TG-Markerpeptiden (8 bis 11 Aminosäuren), der Etablierung einer neuen Probenentfettung mittels beschleunigter Lösungsmittelextraktion sowie der Optimierung der Bedingungen für Proteinextraktion und tryptischen Verdau wurden restrukturierte Fleisch- und entsprechende Kontrollproben in rohem und erhitztem Zustand untersucht.
Anhand der Detektion von vier ausgewählten TG-Markerpeptiden mit jeweils drei Massenübergängen war ein sicherer Nachweis des Bindungssystems möglich und es wurden keine falsch positiven bzw. falsch negativen Ergebnisse erhalten. Untersuchungen von unterschiedlich vorbehandelten Fleischproben (Ölmarinade, Emulsionsmarinade, Gewürzsalz und Panade) zeigten, dass die Fleischvorbehandlung nur geringe Auswirkungen auf die Nachweisbarkeit von TG hat. Die Nachweisgrenzen der entwickelten Methode lagen sowohl für rohes als auch für erhitztes Fleisch etwa um den Faktor 10 unter den empfohlenen TG-Zugabemengen und damit in einem Konzentrationsbereich, in dem keine Bindungseffizienz mehr erzielt werden konnte. Durch die zusätzliche Bestimmung von Casein-Markerpeptiden konnte zudem ein simultaner Nachweis von potenziell allergenen Milchproteinen realisiert werden.
Anhand der Untersuchung von restrukturierten Rohschinken, die mit verschiedenen TG-Konzentrationen hergestellt worden waren, wurde überprüft, ob die proteolytische Aktivität während der Rohschinkenreifung zu einem Abbau von TG und damit zu einer Abnahme der Nachweisbarkeit der TG-Markerpeptide führt. Dabei konnte gezeigt werden, dass es während der 43-tägigen Lagerung zu keiner signifikanten Abnahme der Nachweisbarkeit von TG kam. Durch den Einsatz von mittels mikrowellenaktivierter Festphasensynthese hergestellten isotopenmarkierten Peptiden als internen Standardverbindungen konnten die Gehalte an zwei ausgewählten TG-Markerpeptiden ermittelt werden. Diese zeichneten sich durch gute Wiederfindungsraten aus und wiesen hohe Korrelationen zu der eingesetzten TG-Konzentration auf. Die Nachweisgrenzen der TG-Markerpeptide lagen etwa um den Faktor 20 unter der empfohlenen TG-Zugabemenge. Die für die TG-Analytik etablierte HPLC-MS/MS-Methode wurde auf Basis der hierbei verwendeten Proteinextraktions- und Verdaubedingungen zu einem simultanen Nachweisverfahren von TG und FT weiterentwickelt, indem jeweils sechs charakteristische Markerpeptide für Fibrinogen von Rind und Schwein (8 bis 16 Aminosäuren) in die bestehende Analysenmethode integriert wurden.
Es konnte gezeigt werden, dass eine Differenzierung von FT von Rind und Schwein sowie ein simultaner Nachweis von TG und FT möglich ist. Bei Einsatz der für die Restrukturierung von Rind- und Schweinefleisch empfohlenen Mengen an FT der gleichen Tierart wiesen die Fibrinogen-Markerpeptide in restrukturiertem Fleisch im Vergleich zu den aus dem Restblut der Fleisch-Kontrollproben stammenden Fibrinogen-Markerpeptiden etwa um den Faktor 100 erhöhte Peakflächen auf. Diese signifikanten Erhöhungen konnten anhand der mit Hilfe des Einsatzes von isotopenmarkierten internen Standardverbindungen ermittelten Gehalte von ausgewählten Fibrinogen-Markerpeptiden bestätigt werden. Eine Differenzierung der Verwendung von FT und Blutplasmapulver könnte anhand der Peakflächenverhältnisse von Fibrinogen- zu Serotransferrin-Markerpeptiden vorgenommen werden.