Massenspektrometrische Identifizierung und biologische Charakterisierung des HLA-Peptidoms bei Melanomen
Jarmalavicius, Saulius - Freie Universität Berlin (2013)
Ziel der Arbeit war die Aufklärung des HLA-Peptidoms von Melanomen. Dazu wurden die Peptide von affinitätsgereinigten HLA vier humaner Melanomzelllinien extrahiert, mit zweidimensionaler HPLC aufgetrennt und per MALDI-TOF- und ESI-Q-TOF-Massenspektrometrie sequenziert. Die Spektren wurden mit datenbankbasierten und de novo Verfahren analysiert, sodass Mutationen und Modifikationen der Peptide erkannt werden konnten. Zur Untersuchung der zellbiologischen und immunologischen Grundlagen der Antigenität der Quellproteine der HLA-Liganden wurden ihre mRNA-Expressionwerte mit denen der Transkriptome der Zellen verglichen und ihre Immunogenität in Assays mit T-Zellen aus peripherem Blut von Melanompatienten und gesunden Spendern sowie Tumorinfiltraten untersucht.
Insgesamt wurden 499 HLA-gebundene Peptide von 306 verschiedenen Quellproteinen identifiziert; 289 waren bislang noch nicht beschrieben worden. Im Gegensatz zu der Hypothese, dass Tumorantigenität auf Neoantigene beruht, wurde kein einziges mutiertes Peptid gefunden. Ein Peptid aus GPS2 wurde in drei Varianten mit unmethyliertem, monomethyliertem oder asymmetrisch dimethyliertem Arginin gefunden. Die Peptidome unterschiedlicher Zelllinien erwiesen sich trotz partiell übereinstimmender HLA als hochgradig individualisiert. Im Gegensatz zu der Hypothese, dass HLA primär Peptide hochexprimierter oder kurzlebiger Proteine präsentieren, wurde gefunden, dass nahezu 90 % der Peptide in den HLA-Peptidomen aus niedrig bis intermediär exprimierten Proteinen stammen, die in den Tumoren bis auf wenige Ausnahmen nicht überexprimiert waren und deren zellulärer Umsatz der Verteilung der Umsatzraten des zellulären Proteoms entsprach. In biologischen Tests erwies sich ein hoher Anteil der HLA-Liganden als immunogen. Das monomethylierte GPS2-Epitop wurde von T Zellen aller untersuchten Patienten erkannt und scheint ebenso wie die Epitope, die bei allen vier Tumorzelllinien nachgewiesen wurden und die aus überexprimierten Proteinen stammten, gute Kandidaten für die Entwicklung therapeutischer Vakzine zu sein. Mit der Arbeit konnten die Peptidome von Melanomen aufgeklärt, eine Reihe weit akzeptierter Hypothesen zur Immunogenität von Tumoren widerlegt und Epitope identifiziert werden, die vielversprechende Kandidaten für die Entwicklung von Vakzinen für die Behandlung von Melanomen sind. Darüber hinaus liefern die identifizierten HLA-Epitope wertvolle Informationen für das Verständnis der Antigenität von Tumoren und für die Selektion von Peptiden durch verschiedene HLA, was für neue Vorhersagealgorithmen verwertbar ist.