Festkörper-NMR Studien zur Struktur und Dynamik von Lipid-Peptid-Komplexen
Heuber, Christiane - Universität Stuttgart (2010)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Lipid-Peptid-Komplexe in der flüssigkristallinen Phase untersucht. Bei den betrachteten Peptiden handelte es sich um Gramicidin A, Melittin, die Peptaibole Trichogin-OMe und Alamethicin(L-Glu(OMe)7;18;19). Ziel der Untersuchungen war es, den Einfluss der Peptide auf die molekularen Eigenschaften in den verschiedenen Bereichen der Lipide zu erfassen, was letztlich Hinweise über den Einbau der Peptide in die Lipidmembran liefern sollte. Als experimentelle Verfahren wurden die Infrarotspektroskopie (FTIR) und Kernresonanzspektroskopie (NMR) eingesetzt.
Die Analyse der symmetrischen CH2-Streckschwingung ergab für alle Trichogin-OMe-Membranen bei Temperaturerhöhung eine deutliche Verschiebung der Bandenmaxima um 3 bis 4 cm-1 zu höheren Wellenzahlen, was eine Zunahme der Konformationsunordnung anzeigte. Aus den Streckschwingungsdaten wurde geschlossen, dass die Konformationsordnung der Kettenregion nach Zugabe von Trichogin-OMe nahezu unbeeinflusst blieb. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde angenommen, dass sich Trichogin-OMe parallel zur Membranoberfläche einlagert ("Carpet-like"-Modell), da in diesem Modell geringere Wechselwirkungen zwischen Trichogin-OMe und den Lipid-Molekülen bestehen. Der langsamere Bewegungsbereich der Lipid-Membranen wurde mit Hilfe der T1r -Experimente untersucht, wobei dieser Bereich hauptsächlich von den Ordnungsdirektorfluktuationen beherrscht wird.
Die beobachteten Änderungen der T1r-Zeiten mit der Probenzusammensetzung konnten auf die unterschiedliche Membransteifigkeit zurückgeführt werden. Für die Probe mit dem höchsten Trichogin-OMe-Anteil wurde eine erhebliche Änderung der Kopfgruppenorientierung des Lipids festgestellt. Zusätzlich reflektierte eine zweite spektrale Komponente im 31P MAS/NMR-Spektrum die Dehydrierung der Kopfgruppe, die durch starke Wechselwirkungen zwischen Lipid und Trichogin-OMe verursacht wurde. Aufgrund dessen wurde angenommen, dass sich Trichogin-OMe (L/P = 5/1) nach dem "toroidal"-Modell einlagerte, da für dieses Modell der engste Kontakt zwischen dem Lipid-Molekül und dem Peptid erwartet wurde.
Durch den Einbau der Peptide Alamethicin, Gramicidin und Melittin wurde eine Verlangsamung der Ordnungsdirektorfluktuationen festgestellt, hervorgerufen durch die Einlagerung der Peptide und eine damit verbundene höhere Membranfestigkeit. Dieses Ergebnis unterschied sich von den Membranen mit dem Peptid Trichogin-OMe (für das L/P-Verhältnis größer 10/1), denn hier nahmen nach Zugabe von Peptid die Ordnungsdirektorfluktuationen zu und wurden erst bei größerem Peptid-Anteil langsamer. Für die Trichogin-OMe-Systeme wurde das "carpet-like" Modell angenommen. Für die Membranen, die Alamethicin, Gramicidin und Melittin enthalten, geht man von dem "toroidal" oder "barrel-stave" Modell aus, da durch diese Modelle die bessere Packung und die höhere Membranfestigkeit erklärt werden. Für die Proben mit Melittin und Gramicidin mit einem Lipid/Peptid-Verhältnis von 10/1 wurden erheblich kleinere quadrupolare Kopplungskonstanten (14N) und chemische Verschiebungsanisotropien (31P) bestimmt. Diese geringeren Werte deuten eine Änderung der Kopfgruppenorientierung an und können mit dem "toroidal"-Modell begründet werden, denn hier bewegen sich die DMPC-Moleküle im gekrümmten Membranteil schneller.
Für das Gramicidin-System mit dem L/P-Verhältnis von 5/1 wurde im statischen 31P und 14N NMR-Spektrum mehr als eine Komponente beobachtet. Aufgrund dessen wurde von einer Änderung der Kopfgruppenorientierung ausgegangen. Die Peptide lagern sich nach dem "barrel-stave" Modell ein, denn in diesem Modell ist die Lipid-Bewegung insgesamt eingeschränkter als für das "toroidal" Modell, da hier kein gekrümmter Membranteil aus Lipid-Molekülen vorliegt.
Im Fall des Peptids Alamethicin standen verschiedene Proben zur Verfügung, die jeweils an unterschiedlichen Positionen mit der Spinsonde TOAC markiert waren. Der aus der Spinsonde resultierende paramagnetische Beitrag in den Spektren bzw. in den Relaxationszeiten der Lipid-Moleküle sollte dazu verwendet werden, die Orientierung der Peptidmoleküle in der Lipidmembran zu bestimmen. Die Spinsonden TOAC8 und TOAC16 im Peptid verursachten die größten paramagnetischen Beiträge am Ende der Alkylketten im Lipid-Molekül, sowohl in den 1H T1- als auch in den 13C T1- Messungen. Zusätzlich wurden für die Membran mit TOAC16 eine Verbreiterung des 1H Signals im Bereich der Kettenregion festgestellt. Für die Spinsonde TOAC1 wurde der größte Einfluss auf den Bereich der Kopfgruppe und des Glycerolrückgrats des Lipids festgestellt. Aus diesen Ergebnissen wurde auf eine integrale Einlagerung des Peptids Alamethicin in die DMPC-Membran geschlossen, da nur anhand dieses Modells die Einflüsse auf die unterschiedlichen Lipidbereiche zu erklären sind.