Entwicklung immunchemischer Methoden zur Spurenanalytik der Sprengstoffe Nitropenta und Trinitrotoluol
Hesse, Almut - Humboldt-Universität Berlin (2017)
Der Sprengstoff PETN ist äußerst schwer zu detektieren. Ein verbesserter anti-PETN-Antikörper wurde durch Anwendung des Bioisosterie-Konzepts entwickelt. Diese polyklonalen IgGs sind sehr selektiv und sensitiv. Die Nachweisgrenze des ELISAs beträgt 0,15 µg/L. Der Messbereich des Immunoassays liegt zwischen 1 und 1000 µg/L. Die Antikörper sind recht pH-stabil als auch robust gegen Lösungsmittelzusätze. Für die Umweltanalytik von TNT wurde eine HPLC-kompatible Affinitätssäule mit porösem Glas als Trägermaterial hergestellt. Um die anti-TNT-Antikörper selektiv aus den TNT-Seren zu isolieren, wurde eine Trennung an einer Dinitrophenyl-Affinitätssäule durchgeführt. Zur Optimierung der Kopplungsmethode wurden orangefarbene Dabsyl-Proteine synthetisiert und auf der Oberfläche gebunden. Die Färbung wurde als Indikator für die Ligandendichte verwendet.
Wegen der hohen Affinitätskonstanten der anti-TNT-IgGs lässt sich TNT nicht reversibel von der TNT-Affinitätssäule eluieren. Daher wurde eine neuartige Elutionsmethode entwickelt, die thermische Online-Elution. Die maximale Kapazität einer TNT- Affinitätssäule betrug 650 ng TNT bzw. 10 µg/mL Säulenvolumen. Um die Ligandendichte der TNT-Affinitätssäulen zu bestimmen, wurde ein neues Verfahren entwickelt, da die spektroskopischen Proteinbestimmungsmethoden nicht geeignet waren. Zur Proteinbestimmung wurde eine HPLC-Trennung der Aminosäuren Tyr und Phe ohne vorherige Derivatisierung entwickelt. Die Proteinhydrolysezeit wurde durch Einsatz einer Mikrowelle von 22 h auf 30 min verkürzt. Zur internen Kalibrierung wurden HTyr und FPhe verwendet. Die Nachweisgrenze bei 215 nm ist sowohl für Tyr als auch für Phe 0,05 µM (~ 10 µg/L). Dieses neue Verfahren, das als Aromatische Aminosäureanalyse (AAAA) bezeichnet werden kann, wurde zur Proteinbestimmung von homogenen Proben mit NIST-BSA validiert, wobei die Nachweisgrenze für Proteine 16 mg/L (~ 300 ng BSA) ist. Die relative Standardabweichung incl. der Hydrolysestufe beträgt 5%.