Kristallographische und biochemische Charakterisierung des Golgi-assoziierten Proteins GRASP65 und seines Hefehomologen Grh1
Haas , Claudia - Freie Universität Berlin (2012)
Ziel dieser Arbeit war die strukturelle Charakterisierung der homologen Proteine GRASP65 (Homo sapiens) und Grh1 (Saccharomyces cerevisiae) mittels Röntgenkristallographie, sowie die Untersuchung des Bindemechanismus von GRASP65•GM130 und Grh1•Bug1 bzw. Grh1•Uso1.
GRASP65 ist in der Stapelung von Golgi-Zisternen involviert und befindet sich an der cis-Seite des Golgi-Apparates. Durch Interaktion mit dem Golgin GM130 vermittelt GRASP65 das Andocken von Transportvesikeln an die Golgi-Membran. Grh1 ist das GRASP65-Homolog in der Knosphefe Saccharomyces cerevisiae. Wie sein humanes Pendant ist auch Grh1 am Golgi-Apparat lokalisiert. Beide Proteine können in zwei Regionen unterteilt werden: eine N-terminale GRASP- und eine C-terminale SPR-Domäne, wobei die GRASP-Domäne wiederum in zwei PDZ-Domäne unterteilt wird.
Die Strukturanalyse der beiden einzelnen PDZ-Domänen von GRASP65, GRASP65PDZ1 und GRASP65PDZ2 zeigt für beide Strukturen eindeutig eine β-sandwich Faltung, wie sie auch für andere PDZ-Domänen beschreiben wurde. Es wurden Bindungsstudien von GRASP65 mit dem bekannten Interaktionspartner GM130 durchgeführt. Im Gegensatz zu bereits publizierten Daten konnte keine Bindung von GM130-Peptiden an die zweite PDZ-Domäne von GRASP65 nachgewiesen werden. Für eine Interaktion mit GM130 ist die vollständige GRASP-Domäne notwendig. Die Bindungskonstante dieser Interaktion liegt mit KD=10,0 ± 2,9 µM innerhalb des Bereiches, der auch für andere PDZ-Peptid-Interaktionen ermittelt wurde.
Da eine Co-Kristallisation der GRASP-Domäne von GRASP65 und GM130 nicht möglich war, wurden in einem Modell die beiden kristallographisch bestimmten PDZ-Domänen von GRASP65 zu einer GRASP-Domäne kombiniert und das GM130-Peptid eingepasst. Es zeigte sich das typische Bindungsmuster eines Klasse I-Peptids in die Peptid-Bindungstasche einer PDZ-Domäne, das mit Funktionsstudien anderer PDZ-Domänen gut in Einklang zu bringen ist.
Der strukturelle Vergleich von GRASP65PDZ1 und der ersten PDZ-Domäne von Grh1, Grh1PDZ1βB, zeigt große Übereinstimmungen. Bisher konnte jedoch nicht abschließend geklärt werden, welche Funktion Grh1 in Hefe hat, denn die Knosphefe verfügt, im Gegensatz zu Säugerzellen, über keine zu Golgi-Stapeln organisierten Zisternen. Daher wirft das Vorkommen eines Proteins, das in die Stapelung von Golgi-Zisternen involviert ist, Fragen zu seiner Funktion auf. Bindungsstudien, analog zu GRASP65, mit potentiellen Interaktionspartnern von Grh1 wie Bug1 und Uso1, sollten Hinweise auf eine mögliche Funktion geben. Obwohl eine Vielzahl unterschiedlicher Grh11-Konstrukte hergestellt und getestet wurde, konnte keine der Interaktionen bestätigt werden. Die Frage der genauen Funktion von Grh1 bleibt offen.