Thermodynamische, kinetische und einzelmolekülspektroskopische Untersuchungen an der mitochondrialen H+-ATPsynthase aus Saccharomyces cerevisiae
Förster, Kathrin - Albert-Ludwigs-Universität Freiburg (2011)
Die H+-ATPsynthase aus Saccharomyces cerevisiae (MF0F1) ist ein transmembraner Enzymkomplex, der einen Protonentransport über die innere Mitochondrienmembran mit der Synthese und Hydrolyse von ATP koppelt. Das Enzym wurde aus S.cerevisiae-Zellen isoliert und biochemisch charakterisiert. Eine MS-Untersuchung nach einer SDS-PAGE zeigte die Anwesenheit aller bekannten Untereinheiten außer der Untereinheit K. MF0F1 wurde in Liposomen rekonstituiert und die ATP-Synthese durch eine elektrochemische Potentialdifferenz der Protonen angetrieben (ΔpH und Δφ). Der maximale Turnover der ATP-Synthese war T=120s-1.
In vivo liegt MF0F1 als Dimer vor. Eine native PAGE zeigte, dass MF0F1 bei der Isolation in monomerer Form gewonnen wurde. Um zu klären, ob eine Dimerisierung in der Liposomenmembran während der Rekonstitution stattfindet, wurde eine Konzentrationsreihe von 0,1 bis 1 MF0F1 pro Liposom hergestellt. Der Turnover ist unabhängig von der Anzahl der Enzyme pro Liposom und damit auf monomeres MF0F1 zurückzuführen.
Es wurde die Abhängigkeit des Turnovers von der Phosphatkonzentration bei verschiedenen pHa-Werten gemessen. Die erhaltenen Km-Werte nahmen mit steigendem pHa ab. Wurde der Turnover der ATP-Synthese gegen die Konzentration der Phosphatspezies H2PO4- aufgetragen, konnten alle Messpunkte durch eine einzige Michaelis-Menten-Kinetik beschrieben werden (Km=120±20 µM, v_max=120±20s-1). Daraus wurde gefolgert, dass H2PO4- die Phosphatspezies ist, die während der ATP-Synthese an MF0F1 bindet.
Die Abhängigkeit des Turnovers der ATP-Synthese vom pHi bei vier verschiedenen Δφ (133mV, 56mV, 27mV, 0mV) zeigte jeweils einen sigmoidalen Verlauf. Es wurde bei jedem Δφ ein maximaler Turnover bei pHa=5,0 erreicht, wobei dieser maximale Turnover abhängig von Δφ war. Das Ergebnis wies darauf hin, dass ΔpH und Δφ weit ab vom chemischen Gleichgewicht kinetisch nicht äquivalent sind.
Das H+/ATP-Verhältnis beschreibt die Anzahl der Protonen, die pro synthetisiertem ATP über die Membran transportiert werden. Während der ATP-Synthese passieren die Protonen die Membran über den c-Ring, wobei jede c-Untereinheit ein Proton bindet. MF0F1 besitzt 10 und die H+-ATPsynthase aus Chloroplasten (CF0F1) 14 c-Untereinheiten, was vermuten ließ, dass das H+/ATP-Verhältnis unterschiedlich ist. Um das Verhältnis zu quantifizieren, wurden Messungen nahe des thermodynamischen Gleichgewichts mit beiden Enzymen durchgeführt. Auf Grundlage der chemiosmotischen Theorie wurde daraus das H+/ATP-Verhältnis für MF0F1 (n=2,9±0,3) und CF0F1 (n=3,9±0,3) berechnet. Zur Kontrolle wurde aus den Messungen die Freie Standard-Enthalpie der Phosphorylierungsreaktion für beide Enzyme bestimmt. Die Werte für MF0F1 (G'°=37±3kJmol-1) und CF0F1 (G'°=36±3kJmol-1) waren im Rahmen der Fehler gleich. H+-ATPsynthasen zeigen während der Katalyse zyklische Konformationsänderungen, bei denen ein Teilkomplex des Enzyms (Rotor) relativ zu den anderen Untereinheiten (Stator) rotiert. Es wurde untersucht, ob es möglich ist, den Rotationsmechanismus an MF0F1 mit Hilfe von Einzelmolekül-FRET-Spektroskopie zu zeigen. Zunächst wurde eine Doppel-Cysteinmutante von MF0F1 hergestellt, die sowohl im Rotor als auch im Stator eine Cysteinmutation besaß. Die Doppel-Cysteinmutante wurde statistisch mit zwei Fluorophoren (ATTO532 und ATTO610) markiert. Eine SDS-PAGE zeigte, dass das Enzym an den Untereinheiten b und γ und an einem endogenen Cystein der Untereinheit OSCP markiert wurde. Das doppelt markierte Enzym wurde in Liposomen rekonstituiert und spFRET-Messungen durchgeführt. Diese Methode ermöglicht es, über die Effizienz des Energietransfers zwischen ATTO532 (Donor) und ATTO610 (Akzeptor) Rückschlüsse auf den Abstand der beiden Fluorophore voneinander zu ziehen. Unter nicht katalytischen Bedingungen war der Abstand zwischen den Fluorophoren konstant. Ein Histogramm der mittleren FRET-Effizienzen zeigte drei nahe beieinander liegende Populationen mit geringer FRET-Effizienz und eine Population mit hoher FRET-Effizienz. Ein Vergleich mit einem zuvor entwickelten Homologiemodell von MF0F1 zeigte, dass die drei Populationen mit geringer FRET-Effizienz auf den strahlungslosen Energietransfer zwischen den Fluorophoren an den Untereinheiten γ und b in den drei möglichen Ausrichtungen des Rotors relativ zum Stator zurückgeführt werden konnten. Die Population mit hoher FRET-Effizienz wurde der Wechselwirkung zwischen den Fluorophoren gebunden an den Untereinheiten b und OSCP zugeordnet. Messungen des spFRET unter ATP-Hydrolysebedingungen ergaben Photonenbursts mit variierender FRET-Effizienz. Es wurden 67 zweistufige und 13 dreistufige Photonenbursts gefunden. Damit wurde zum ersten Mal der Rotationsmechanismus an einer mitochondrialen H+-ATPsynthase mittels Einzelmolekülspektroskopie gezeigt.