HPLC-Analytik des Vitamin C
Focke, Cornelia Marlene - Universität Lübeck (2010)
L-Ascorbinsäure spielt eine facettenreiche Rolle im menschlichen Organismus; ihr Nutzen in Prävention und Therapie vieler Erkrankungen ist derzeit noch wenig verstanden und aktuell Gegenstand der Forschung.
In der vorliegenden Arbeit wurde die von Liau et al. beschriebene RP-HPLC-Methode mit UV-Detektion zur Messung von Ascorbinsäurespiegeln im Plasma optimiert und an die Gegebenheiten des Zentrallabors angepasst. Verwendet wurde eine Synergi 4u Hydro-RP C18 150 x 4,6 mm Säule und eine mobile Phase aus 20 mM Ammoniumdihydrogen-Phosphat und 0,015 % meta-Phosphorsäure bei einem pH von 2,55, mit 3-Amino-4-hydroxybenzoesäure als internem Standard. Serum- oder Lithium-Heparin-Proben wurden mit einem Gemisch aus 10 % meta-Phosphorsäure und 1 % Perchlorsäure stabilisiert und (ausgefällt) deproteiniert. Die insgesamt siebenminütige HPLC-Messung erfolgte per UV-Detektion bei 245 nm, bei einer Flussrate von 1ml/min. Die Retentionszeit der Ascorbinsäure betrug dabei 2,9 min, die des internen Standards 3,4 min. Die optimierte Methode hat eine Nachweisgrenze von 96 ng/ml. Die Unrichtigkeit der Messung lag konzentrationsabhängig zwischen 0,03 % und 0,08 %. Der Variationskoeffizient der Impräzision in Serie betrug konzentrationsabhängig 0,05-0,7 %, in der Tag-zu-Tag-Impräzision 4,2 % für Serumproben, 8,2 % für Plasmaproben. Die Messung von Ascorbinsäurekonzentrationen war linear von 2-700 μmol/l. Die vorliegende Methode könnte prinzipiell auch für Liquor- und Urinuntersuchungen modifiziert werden.
Mit 10 % meta-Phosphorsäure und 1 % Perchlorsäure versetzte und bei -20 °C eingefrorene Serum- oder Lithium-Heparin-Proben konnten 35 Tage ohne Konzentrationsverluste gelagert werden. Zur Referenzwerteerstellung wurden Serumproben von 150 Blutspendern zwischen 18 und 67 Jahren (m: 95, w: 55) analysiert. Der ermittelte Vitamin C-Plasma-Referenzbereich betrug 25-120 μmol/l.
Frauen hatten dabei signifikant höhere Vitamin C-Plasmaspiegel (24-136 μmol/l) als Männer (23-116 μmol/l). In pharmakokinetischen Untersuchungen zeigten sich deutlich höhere erreichbare Ascorbinsäure-Plasmakonzentrationen nach intravenöser Applikation von 500 mg Vitamin C als nach oraler Gabe der selben Dosis.