NMR Strukturanalyse der 1-Deoxy-d-xylulose-5-phosphat Reduktoisomerase
Englert, Nadine Esther - Universität Gießen (2012)
Die 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat Reduktoisomerase (DXR, EC 1.1.1.267) katalysiert den zweiten Schritt des 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthese-Weges (DOXP-Weg) der Isoprenoidsynthese. Dieses Enzym kommt in den meisten Bakterien, Apikomplexa und in den Plastiden von Pflanzen vor, aber nicht in Menschen. Daher stellt es eine attraktive Zielstruktur für antibakterielle und antiparasitische Wirkstoffe sowie Herbizide dar.
Fosmidomycin, FR900098 und deren Analoga sind Inhibitoren der DXR und stellten sich in ersten klinischen Studien als wirksame Inhibitoren gegen bakterielle Infektionen und Malaria heraus. Bei Malaria besteht laufend Bedarf an neuen Medikamenten, da sich regelmäßig Resistenzen der Plasmodien gegen gängige Wirkstoffe ausbilden.
Die DOXP-Reduktoisomerase wird als ein sehr flexibles Enzym postuliert. Um sowohl die Flexibilität als auch die Interaktion zwischen Inhibitor und DXR zu untersuchen, wurde die DXR rekombinant in Escherichia coli exprimiert, aufgereinigt und anschließend mittels NMR-Experimente analysiert. Diese Arbeit beschreibt die Optimierung der DXR-Probe für die NMR-Messungen, die partielle Zuordnung des Proteinrückgrats und der Seitenkettenatome sowie die Sekundär-strukturvorhersage mit TALOS und NMR-Bindungsstudien der DXR zum Inhibitor FR900098. Die gewonnenen Daten bieten eine Grundlage für weitere NMR-gestützte Strukturanalysen der DXR und ihrer Interaktion mit unterschiedlichen Inhibitoren.
15N-, 13C- und 2H-markierte DXR-Proben wurden unter Sauerstoffausschluss und Zugabe von Mg2+, NADPH und FR900098 hergestellt. Dadurch konnten 44 % der chemischen Verschiebungssignale von 1HN und 15NH des Proteinrückgrats zugeordnet werden. Anhand 13C-Verschiebungen konnten 50 % des Proteinrückgrats der Primärstruktur zugeordnet werden. Mit TALOS lassen sich aus den chemischen Verschiebungen Rückschlüsse auf die Sekundärstruktur der DXR ziehen. So konnten Sekundärstrukturvorhersagen für die zugeordneten Fragmente getroffen werden. Diese wurden mit publizierten (aus der pdb-Datenbank) Kristallstrukturen verglichen. Die TALOS-Daten lieferten eine große Übereinstimmung zu den Kristallstrukturdaten. Als Ausnahme wurden Abweichungen in dem Bereich der flexiblen Schleife festgestellt. Der Vergleich mit den vorher veröffentlichten Kristallstrukturen ergab, dass die Fragmente der DXR, die zugeordnet werden konnten, hauptsächlich in den äußeren Bereichen liegen und gleichzeitig eine alpha-helikale Struktur aufweisen. Proteinsequenzen, die in der Tertiärstruktur eher innen zu verorten sind oder in der Kristallstruktur beta-Faltblattregionen darstellten, konnten nur zu einem geringen Anteil zugeordnet werden.
Diese Arbeit liefert weitreichende Daten für weitere NMR-Analysen der DXR, für allgemeine Strategien zur NMR-Analyse von großen Proteinen (>40 kDa) sowie zur Herstellung und NMR-Messung von sauerstoffempfindlichen Proteinen.