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28.03.2024
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Screening, biochemische Charakterisierung und Strukturaufklärung mikrobieller Threonin-Aldolasen

Dückers, Nina - Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf (2012)


Aldolasen, die die C-C-Verknüpfung von Benzaldehyd und Glycin unter Bildung von Phenylserin katalysieren, sind im Prinzip literaturbekannt, natürlicherweise handelt es sich dabei um Threonin-Aldolasen. Da bei dieser Synthese zwei neue Asymmetriezentren (in α- und ß-Position) gebildet werden, werden allerdings hohe Anforderungen an die Enantio- und Diastereoselektivität dieser Enzyme gestellt. Bei Auswertung der Literaturdaten zeigt sich, dass die bislang beschriebenen Enzyme Produkte bilden, die durchweg in α-Position eine hohe Enantioselektivität (> 99% ee) zeigen, während alle bislang bekannten Enzyme nur eine niedrige Diastereoselektivität in β-Position aufweisen.

Threonin-Aldolasen und verwandte Enzyme mit Threonin-Aldolase-Aktivität (z.B. die Serinhydroxymethyltransferasen SHMTs) können für die Synthese von multifunktionellen β-Hydroxy-α-aminosäuren genutzt werden, da sie in der Lage sind, die stereoselektive C-C Knüpfung unter Entstehung zweier neuer Chiralitätszentren in einem einzelnen Schritt zu katalysieren. Diese β-Hydroxy-α-aminosäuren sind bedeutende chirale Bausteine für die Synthese biologisch aktiver Moleküle, die in den letzten Jahren für chemisch industrielle Prozesse, insbesondere für die Pharma-Industrie, an steigendem Interesse gewonnen haben. Jedoch gibt es einige Limitierungen der Threonin-Aldolase-Reaktion, wie die meist unzureichenden Umsätze und Ausbeuten und die geringen Diastereoselektivitäten im Vergleich zu exzellenten Enantioselektivitäten (bis zu 99% ee). Ziel dieser Arbeit war es, verbesserte Enzyme mit optimierter Diastereoselektivität für die Synthese der chiralen β-Hydroxy-α-aminosäuren zu identifizieren und zu isolieren und somit den Limitierungen der konventionellen chemischen Synthese-Prozesse nachzukommen.

Zwei literaturbekannte Enzyme (aus E. coli und Saccharomyces cerevisiae) sind für dieses Projekt rekombinant verfügbar gemacht worden, da sie als Referenzenzyme für methodische Ausarbeitungen gut einsetzbar sind, beispielsweise für die Entwicklung einer Immobilisierungsmethode, für die Etablierung einer Enantio- und Distereomeren-Analytik oder die Ausarbeitung einer Hochzelldichte-Fermentation zur Gewinnung größerer Zellmassen. Ausgehend von der Threonin-Aldolase LTAE aus E. coli wurde eine gezielte Mutagenese durchgeführt, um optimierte Enzyme mit verbesserter Diastereoselektivität zu erhalten. Eine Mutante zeigte eine verbesserte Diastereoselektivität im Vergleich zum Wildtyp-Enzym und eine sehr hohe Aktivität für die Spaltung von Threonin in der Retro-Aldolreaktion. Außerdem wurde die LTAE im Rahmen dieser Arbeit kristallisiert und die Struktur des Enzyms (sowohl Apo-Enzym als auch Enzym mit Substrat Glycin) aufgeklärt. Mittels verschiedener Screeningansätze sollten im Rahmen dieser Arbeit neue Threonin-Aldolasen mit optimierter Diastereoselektivität für die Synthese eines relevanten Intermediates der Thiamphenicol-Synthese, einer ß-Hydroxy-α-aminosäure, zugänglich gemacht werden. Ziel war es hierbei, hoch threo-spezifische Enzyme zu identifizieren, da nur die threo-Verbindung als chirales Intermediat für Folgesynthesen von großer Bedeutung ist.

Hierbei wurde zum einen definierte Stammsammlungen nach neuen, vielversprechenden Enzymen durchsucht, zum anderen wurden verschiedene Bodenproben mit der zu verwertenden Kohlenstoff-Quelle (Phenylserin, einer ß-Hydroxy-α-aminosäure) angereichert und auf Threonin-Aldolase-Aktivität getestet. Außerdem wurde ein "in Silico"-Screening auf Basis der beiden bekannten Threonin-Aldolase-Sequenzen (E. coli und S. cerevisiae TA) durchgeführt.

Der Zugang zu den neuen Enzymen sollte durch eine selektionsbasiertes Screening mithilfe eines speziellen Selektions-Systems in Pseudomonas putida KT2440 gewährleistet werden. Dieser Stamm ist in der Lage auf Benzaldehyd, dem Spaltprodukt der Threonin-Aldolase-Reaktion ausgehend von Phenylserin als Substrat, zu wachsen, indem er dieses im Mandelat-Abbauweg verstoffwechselt. Jedoch verfügt der Stamm auch über eine eigene, aktive Threonin-Aldolase (PpTA), die ebenfalls näher untersucht wurde, und kann nur nach Deletion dieses Gens als Selektions-Stamm für die Identifizierung neuer Aldolase-Gene genutzt werden. Die Konstruktion dieser Deletionsmutante des Selektions-Stammes konnte jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr erfolgen.

Die verschiedenen Screening-Ansätze erwiesen sich als erfolgreich. Es konnten neue Enzyme mit deutlich verbesserten d.r.-Werten in der Aldolreaktion für die ß-Hydroxy-α-aminosäure Phenylserin gefunden werden. Enzyme mit sehr guten Diastereoselektivitäten für die threo-Verbindung als Produkt wurden in in Bodenproben-Stämmen, durch Anreicherung dieser Organismen mit Phenylserin, gefunden. Diese lieferten im Vergleich zu den bisher in der Literatur beschriebenen Enzymen signifikant verbesserte Resultate für die enzymatische Aldolreaktion. Das "in Silico-Screening" lieferte 5 neue rekombinante Enzyme mit threo-Spezifität, wobei hier die Umsätze für die enzymatische Aldreaktion sehr hoch waren. Die Etablierung des Selektions-Systmes in P. putida durch Deletion des Stamm-eigenen TA-Gens würde einen Zugang zu diesen neuen Threonin-Aldolase-Genen liefern.


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