Biochemische, strukturelle und kinetische Charakterisierung des ungewöhnlichen c-Typ Cytochroms Thiosulfatdehydrogenase
Denkmann, Kevin - Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn (2015)
Thiosulfatdehydrogenasen sind Dihäm c-Typ Cytochrome mit einer ungewöhnlichen His/Cys-Koordination eines Hämes und weit verbreitet unter Bakterien. TsdA-Proteine kommen in allen Gruppen der Proteobakterien und auch in grampositiven Organismen vor. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die TsdA-Proteine aus A. vinosum und C. jejuni als typische Vertreter dieser Enzymklasse heterolog in E. coli produziert und biochemisch charakterisiert. Die Enzyme aus diesen beiden Organismen dienen als Beispiel für die zwei Funktionsweisen der TsdA-Proteine, die Oxidation von Thiosulfat und die Reduktion von Tetrathionat. In Enzymtests konnte gezeigt werden, dass die TsdA aus A. vinosum als Thiosulfatdehydrogenase fungiert, ähnlich wie homologe Proteine aus T. intermedia oder P. stutzeri. Im Gegensatz dazu ist die TsdA aus C. jejuni ein bifunktionales Enzym mit einer primären Funktion als Tetrathionatreduktase. Diese Funktion verleiht dem Enzym zusätzliche, physiologische Relevanz, da die TsdA humanpathogenen Bakterien wie C. jejuni einen Wachstumsvorteil in der Darmflora verschaffen könnte.
Am Beispiel der TsdA aus A. vinosum konnte über UV-Vis Spektren gezeigt werden, dass das konservierte Cystein, das als distaler Ligand eines Hämes fungiert, pH-abhängigen und Redox-abhängigen Veränderungen unterliegt. Anhand von AvTsdA Cystein96-Varianten wurde bewiesen, dass das Cystein essentiell für die katalytische Aktivität ist und eine stabilisierende Funktion innerhalb der TsdA hat. Das zweite Häm wird in der oxidierten AvTsdA His/Lys-ligiert und vollführt einen Redox-abhängigen Ligandenwechsel zu einer His/Met-Koordination im reduzierten Zustand des Proteins. Anhand von TsdA Lysin- und Methionin-Varianten konnte gezeigt werden, dass die Häm-Eisen Koordination dieses Hämes einen starken Einfluss auf, sowohl die maximale spezifische Aktivität als auch die Substrataffinität zu Thiosulfat und Tetrathionat, hat.
Die AvTsdA überträgt Elektronen vermutlich zunächst auf ein Dihäm c-Typ Cytochrom, von dem die Elektronen auf das Eisen-Schwefel Cluster Protein HiPIP (Alvin_2274) und schließlich auf das photosynthetische Reaktionszentrum weitergeleitet werden. C. jejuni dagegen betreibt keine Photosynthese und die Elektronen werden von der CjTsdA auf ein Monohäm c-Typ Cytochrom und dann vermutlich auf die terminale cb-Oxidase übertragen. Mehrere Organismen wie z. B. T. intermedia, exprimieren ein weiteres c-Typ Cytochrom (TsdB), welches als Elektronenakzeptor für die TsdA dienen kann.