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Strukturuntersuchungen verschiedener Mutanten des Maltose-Bindungsproteins (MBP) mit Hilfe der ESR Spektroskopie

Chakour, Mohammed - Technische Universität Kaiserslautern (2015)


Das malE Gen codiert für die Pre-MBP Vorstufe (396 Aminosäureresten), die bei der Spaltung der sich in der NH2-Terminal befindlichen Erkennungssequenz (26 Aminosäure-Rückstände) die Reife Maltose- Bindungsprotein (370 Aminosäure-Seitenketten) ergibt. Das Maltose-Bindungsprotein ist ein Teil des Maltose/Maltodextrin-Systems von Escherichia coli, verantwortlich für die Aufnahme und den effizienten Katabolismus von Maltodextrin. Die Maltose/Maltodextrin ist ein komplexes regulatorischen Transportsystem mit vielen Proteinen und Proteinkomplexen. MBP erhöht den Ertrag der Fusionspartner in vielen Fällen und ist oft in der Lage, die Löslichkeit der fusionierenden Polypeptide zu erhöhen.

Im Rahmen dieser Arbeit sollten zunächst aus sieben pMAL-Plasmide sieben MBP-Mutanten in ihrem gefalteten (nativen) Zustand exprimiert, durch Amylose Säule aufgereinigt und näher mit ESR-Spektroskopie untersucht werden, wobei die sieben Doppel-Cystein-Mutanten des Maltose-Bindungsproteins (MBP) mit jeweils einer Mutation im aktiven Zentrum bei 298 und dem zweiten Cystein über beide Domänen des Proteins verteilt erzeugt werden sollen. Diese Cysteine könnten mit dem Nitroxid-MTS mittels site-directed Spinlabeling (SDSL) chemisch modifiziert, die Entfernungen zwischen den radikalen Paaren durch 4-fach gepulste Elektron-Elektron-Resonanz (DEER)-Messungen bestimmt und ein Vergleich mit theoretischen Abstandsdaten, die mit MD-Simulationen ermittelt werden.

Geplant war der Einsatz von cw-ESR-Messungen bei Raumtemperatur zur Bestimmung der Mobilität und Umgebung des Spinlabels. Cw-ESR-Tieftemperatur-Messungen bei 150 K und 80 K zur Distanzbestimung zwischen zwei Spinlabeln im Bereich von 0,8 - 2,0 nm (MBP5) und Puls-ESR Experimente bei 50 K für den Abstandsbereich von 2,0 - 8,0 nm zur Detektion zeitaufgelöster konformationeller Änderungen der MBP-Proteine sollten durchgeführt werden.

In Abwesenheit von Denaturanzien bei neutralem pH-Wert ist das Protein im nativen Zustand, während es bei pH 3,3 einen molten globule bildet. Diese Struktur besitzt in CD-Spektren kein Signal im Bereich der Tertiärstruktur aber Sekundärestruktur, dem nativen Zustand ähnlich. Außerdem wollten wir den molten globule Zustand von MBP durch die ANS-Fluoreszenz -Messungen bestimmen, sowie die Bindungsfähigkeit von MBP mit Maltose im molten globule Zustand mittels ITC überprüfen. Circulardichroism-Messungen sollten zusätzlich verwendet werden, um den Intermediär-Zustand zu untersuchen, dadurch würde die Konformation von MBP untersucht werden.

Für die weitere Charakterisierung des molten globule Zustands wäre es zudem erforderlich, diesen zunächst mittels Denaturierungsexperimenten sowohl in UV-CD- als auch Cw-ESR-Spektren aufzuspüren. Angesichts der pH-abhängigen Entfaltung von MBP ist eine zusätzliche Überprüfung der Stabilität von MTS unter diesen Bedingungen unerlässlich.

Mit den daraus erhaltenen Ergebnissen sollen in dieser Arbeit zuerst Referenzabstände von den Mutanten im gefalteten (nativen) Zustand bestimmt und mit theoretischen Abstandsdaten, aus MD-Simulationen verglichen werden. Schließlich soll die Abstände beider Zustände (nativer- und molten globule Zustand) miteinander vergleichen werden.


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