Entwicklung und Anwendungen eines SPR-Biosensor-Assays für Moenomycine und andere Glykosyltransferase-Inhibitoren
Bury, Daniel - Bergische Universität Wuppertal (2015)
Die Antibiotika der Moenomycin-Gruppe sind die einzigen bekannten Naturstoffe, die den vorletzten Schritt der bakteriellen Zellwandsynthese - die Transglykosylierung - durch direkte Bindung an die Peptidoglykan-Glykosyltransferase (PGT) hemmen.
Aufgrund ungünstiger pharmakokinetischer Eigenschaften sind Moenomycine von geringem Nutzen für die Humantherapie. Ein Gemisch von Moenomycinen wird allerdings unter der Bezeichnung Flavophospholipol als Mastförderer in der Nutzviehhaltung eingesetzt. Die Verwendung von Antibiotika in der Humanmedizin und in der Tiermast trägt zur Bildung und Selektion antibiotikaresistenter Krankheitserreger bei. Daher werden fortwährend neue Antibiotika benötigt und die essentielle Funktion der PGT macht sie zu einem attraktiven Target für neue Wirkstoffe. Um der Bildung neuer Resistenzen entgegenzuwirken, ist außerdem seit 2006 der Einsatz von Antibiotika zur Leistungssteigerung EU-weit verboten.
In dieser Arbeit ist die Entwicklung eines SPR-Biosensor-Assays (SPR: surface plasmon resonance) zum Nachweis von Moenomycinen und anderen PGT-Inhibitoren und dessen Anwendung für die Analyse von Futtermitteln und für qualitative Struktur- Wirkungsbeziehungen beschrieben. Der Assay basiert auf der Wechselwirkung zwischen der monofunktionellen PGT MtgA aus Staphylococcus aureus und einem immobilisierten Moenomycin A-Derivat.
Der Assay erwies sich als ausreichend empfindlich, um praxisrelevante Konzentrationen an Flavophospholipol in Futtermitteln nachzuweisen. Die Eignung des Assays zur Futtermittelanalytik wurde anhand von drei verschiedenen Futtermittelmatrices untersucht. In zwei der Matrices war eine sichere Unterscheidung zwischen positiven und negativen Proben möglich. Im dritten Futtermittel führten Matrixeffekte zu falsch positiven Ergebnissen in der undotierten Matrix. Falsch negative Ergebnisse wurden nicht beobachtet.
Außerdem wurde der Assay dazu verwendet, den Wirkmechanismus von PGT-Inhibitoren zu untersuchen, die das natürliche Substrat (Lipid 1 bzw. Lipid 11) imitieren. Alle Inhibitoren führten zu einer Hemmung der MtgA-Bindung an das immobilisierte Moenomycin A, was auf eine Bindung an die Donorbindungsstelle der PGT zurückzuführen ist. Bei niedrigen Konzentrationen der Lipid 11-analogen Inhibitoren wurde allerdings eine erhöhte MtgA- Bindung festgestellt. Es ist anzunehmen, dass die Inhibitoren an die Akzeptorbindungsstelle binden, was zu heteroallosterischer Aktivierung der Donorbindungsstelle führt. Basierend auf dieser Hypothese konnten unterschiedliche Einflüsse der Strukturelemente der Inhibitoren auf die Affinität zur Akzeptorbindungsstelle abgeleitet werden: Die Disaccharidstruktur der Lipid 11-Analoga ist essentiell für die Bindung. Eine Phosphoglyceratgruppe als Bindeglied zwischen Lipidrest und Zuckerrest führt zu einer höheren Affinität, als eine Phosphodiestergruppe. Die Peptidseitenkette führt zu verringerter Affinität.
Der hier beschriebene Assay ist ein empfindliches Werkzeug für den Nachweis von Moenomycinen und die Identifizierung von PGT-Inhibitoren. Die vorgestellten Ergebnisse stellen den ersten Hinweis auf eine positive Kooperativität der Donor- und Akzeptorbindungsstelle von PGT dar. Die Erkenntnisse bezüglich der untersuchten Inhibitoren tragen zum Verständnis der PGT-Hemmung bei und könnten sich auf dem Weg zu neuen Antibiotika als nützlich für die Entwicklung neuer pharmakologischer Leitstrukturen für PGT-Inhibitoren erweisen.