Die Identifizierung von molekularen Markern in Bakterien bei Stressexposition
Brändle, Miriam - Karlsruher Institut für Technologie (KIT) (2010)
Die Fähigkeit von Mikroorganismen sich nicht optimalen Lebensbedingungen durch Veränderung ihrer Genexpression anzupassen, führt sowohl im medizinischen Bereich als auch bei technischen Prozessen, unter anderem durch die Minimierung der Desinfektionseffizienz, zu Problemen. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene molekulare Marker ausgewählt, um bakterielle Stressantworten näher zu identifizieren.
Untersucht wurden die hygienisch relevanten Gram-negativen Bakterien Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coli sowie als Vertreter der Gram-positiven Bakterien Enterococcus faecium und Enterococcus faecalis. Als Stressoren wurden Nährstofflimitierung und eine erhöhte Salzkonzentration eingesetzt. Des Weiteren wurden die verschiedenen Wachstumsphasen der Bakterien analysiert. Die Modellorganismen wurden in ihrer planktonischen und adhärenten Lebensweise betrachtet.
Bei der Untersuchung von physiologischen Summenparametern zeigte sich bei Enterokokken eine deutliche Zunahme des RNA-Gehalts, während die Zellzahl im gleichen Zeitraum bei Stresseinwirkung abnahm. Zusätzlich konnte ein beginnendes VBNC (viable but nonculturable)-Stadium als eine mögliche Stressantwort festgestellt werden. Zur Betrachtung der spezifischen Stressantwort wurden Genexpressionsanalysen mittels quantitativer PCR und Northern Blot-Analysen mit in dieser Arbeit neu berechneten Sonden und Primern durchgeführt. Dazu wurde zum einen der Sigmafaktor rpoS, der an der Biofilmbildung beteiligte Faktor rcsA bei Gram-negativen Bakterien und das in die Peptidoglykansynthese involvierte pbp5-Gen bei Enterokokken herangezogen. Es konnte eine Induktion von rpoS und erstmals eine stressabhängige Induktion des rcsA-Gen gezeigt werden, während es zu einer Repression des pbp5-Gens bei Stressexposition kam. Beim Vergleich dieser speziesspezifischen Expressionsmuster mit Genen der Usp-Familie, die an der generellen Stressantwort beteiligt sind, wurde deutlich, dass sich diese als allgemeingültige Stressmarker verwenden lassen. Zusätzlich wurden verschiedene Ansätze zur Identifizierung von Stressmustern untersucht, mit denen eine schnelle Erkennung physiologischer Stadien bei Bakterien möglich ist. Mit Hilfe der RAPD-PCR (randomly amplified polymorphic DNA-PCR) wurden sowohl Transkriptom- als auch Genomanalysen durchgeführt, die deutlich Unterschiede zwischen den gestressten Bakterien zeigten und Hinweise auf eine Osmosensitivität von Enterococcus faecalis erbrachten.
Die Ergebnisse der Arbeit unterstreichen die Notwendigkeit weiterer Forschung bei der Stressadaptation von Bakterien im Hinblick auf die schnelle und speziesunabhängige Identifizierung und Bewertung physiologischer Stadien. Aufbauend darauf können Maßnahmen getroffen werden, die es ermöglichen, bakterielle Populationen direkt vor Ort zu manipulieren, um so in Zukunft technische Prozesse optimieren zu können.