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Detektion von Nukleinsäuren basierend auf chemisch-modifizierten Oligonukleotiden

Blechinger, Jenny - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (2015)


Im Rahmen dieser Arbeit wurden Detektionsmethoden für Nukleinsäuren basierend auf chemisch-modifizierten Oligonukleotiden und Fluoreszenzintensitätsänderungen entwickelt. Das grundliegende System für die Detektion bestand aus zwei Konjugaten, deren Enden chemisch modifiziert wurden, welche als Erkennungselement für ein RNA-Target dienten.

Zunächst wurden die beiden Enden der Konjugate mit jeweils einem Fluorophor modifiziert. Diese beiden Fluorophore waren ein FRET-Paar. Im Fall der Hybridisierung der beiden chemisch-modifizierten Stränge mit dem RNA-Target in der Zelle, wurden die Modifikationen in die benötigte räumliche Nähe gebracht, sodass ein Energietransfer (FRET) stattfinden konnte. Auf diese Weise wurde die Detektion einer zellulären RNA mit Hilfe zweier terminal-modifizierten Stränge ermöglicht. Im nächsten Schritt wurde dieser Erfolg auf ein photochemisches System, induziert durch rotes Licht (650 nm), übertragen. Zu diesem Zweck wurde ein Strang mit einem Photosensibilisator verändert, der unter Bestrahlung mit rotem Licht Singulettsauerstoff generierte. Der andere Strang wurde mit einem Substrat modifiziert, welches mit dem generierten Singulettsauerstoff eine Cycloaddition einging. Das zuvor konjugierte System löschte im intakten Zustand die Fluoreszenzintensität benachbarter Fluorophore. Demzufolge konnte nach erfolgter Spaltung, eine Änderung der Fluoreszenzintensität beobachtet werden. Da die generierten reaktiven Sauerstoffspezies geringe Lebensdauern aufweisen, kann dieser Prozess nur ablaufen, wenn der Photosensibilisator und das Substrat sich in räumlicher Nähe zueinander befinden. Diese wurde durch ein RNA-Target ermöglicht. Mit diesem System konnten in vitro und in lebenden Zellen (adhärent und suspensiv) eine mRNA und eine rRNA photokatalytisch mit modifizierten Phosphothioat-DNA-Strängen nachgewiesen werden.

Im Unterkapitel der Entwicklung der Inhibitoren für mikro-RNAs wurde durch Untersuchungen der chemischen Modifikationen, der mismatch-Diskriminierung und der Einfluss der miRNA-seed region bestätigt, dass an den Enden modifizierte Oligonukleotide (14mere) potente und sequenzspezifische Inhibitoren für repräsentative mikroRNAs (92a und 30b) darstellen. Die modifizierten 14mer- zeigten außerdem gegenüber den 21mer-Inhibitoren bessere mismatch-Diskriminierung und sind in zellulärer Umgebung stabil.

Im Kooperationsprojekt, in dem die Wirkung von Clathrochelatkomplexen auf lebende Zellen untersucht werden sollte, zeigten die Cobaltkomplexe keine Effekte auf die Zellviabilität. Die eingesetzten Eisenkomplexe hingegen, insbesondere jener mit sechs Chlorsubstitutenten, zeigten hohe Toxizität (IC50<3µM). Es konnte eine Hypothese über deren Wirkmechanismus, die Erhöhung der reaktiven Sauerstoffspezies, aufgestellt werden und Redoxaktivität gegenüber Ferroceniumionen ausgeschlossen werden.


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