NMR-Spektroskopie an Lipoproteinen und Lipoproteinsubklassen
Baumstark, Daniela - Universität Regensburg (2011)
Lipoproteine stehen als Risikofaktoren für Herz-Kreislauferkrankungen hoch im Fokus des medizinischen Interesses. Strukturelle Veränderungen in LDL können nach heutigem Kenntnisstand zur Ausbildung von Arteriosklerose führen, aber auch das Verhältnis von besonders kleinen HDL oder LDL im Vergleich zu den jeweils größeren Partikeln hat entscheidenden Einfluss auf das Risiko zu erkranken. Zum Verständnis der genauen Mechanismen sind Informationen über Aufbau und Zusammensetzung der Lipoproteine notwendig, welche noch nicht vollständig geklärt sind. Akkurate und effektive Analyseverfahren sind zudem unabdingbar und können zu geeigneten Präventionsmaßnahmen verwendet werden.
In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der NMR-Spektroskopie als nicht invasive Methode neue Erkenntnisse über den Aufbau und die Zusammensetzung von Lipoproteinen erzielt. Detaillierte Untersuchungen von eindimensionalen NMR-Spektren führten zu einem besseren Verständnis der Kurvenform, wodurch auch erste Erkenntnisse über die Struktur von bovinen Lipoproteinen möglich waren. Des Weiteren wurden diverse Methoden zur Isolierung und Quantifizierung der Lipoproteinklassen analysiert und miteinander verglichen.
Ein großer Teilaspekt galt der Evaluierung und Optimierung von Quantifizierungsmethoden. Dazu wurden aus einer Serumprobe eines gesunden Spenders die gängigen Lipoproteinsubklassen und zwei Serumprotein-Fraktionen isoliert. Aliquots dieser Proben wurden zum einen NMR-spektroskopisch, aber auch über enzymatische Analysen zur Cholesterinbestimmung und elektronenmikroskopische Untersuchungen charakterisiert. Es wurde zudem eine Methode etabliert, mit der über einen einfachen Extraktionsschritt und die Messung eines kurzen NMR-Experiments eine quantitative Aussage über die gesamte Lipidverteilung in Serum und den Lipoproteinen erhalten wurde. Über Linearkombination von NMR-Spektren konnte aus den Einzelspektren wieder das ursprüngliche Serumspektrum simuliert werden, was zu einer relativen Verteilung der Lipoproteinklassen und Proteinanteile führte. Methodisch ähnlich wurde über die relativen Diffusionskoeffizienten der isolierten Proben das Diffusionsverhalten von Serum studiert, was ebenfalls zu einer Aussage über die relative Verteilung führte. Durch geeignete Kombination der einzelnen Analysen war letztendlich eine gesamte Beschreibung der Lipid- und Lipoprotein-Zusammensetzung, sowie die Angabe einer ungefähren Konzentration von LDL und HDL in Serum möglich.
Ein weiterer Teilaspekt galt den NMR-Studien derselben Proben unter dem Einfluss von unterschiedlichen Temperaturen und unter Hochdruck. Bei sämtlichen Bedingungen wurden T2 Messungen zur Mobilität der einzelnen zu den Spektren beitragenden Signale angefertigt, welche auf die Beweglichkeit einzelner Lipide in den Partikel schließen ließen. Dabei wurden bekannte Phasenübergänge sowohl im Inneren der Partikel als auch in der Membran erkannt, aber auch eine weitere strukturelle Änderung, die zu einem signifikanten Signalabfall der Methylengruppen bei hohem Druck führte. Anhand dieser Informationen konnten zusätzlich strukturelle Aussagen über die Beschaffenheit von bovinen Lipoproteinen gemacht werden. Sowohl bovines LDL als auch HDL zeigten weniger dicht gepackte Strukturen. Bovines LDL lag außerdem im Vergleich zu HDL in einer sehr einheitlichen Größe vor.
Ein besonderes Augenmerk galt ferner dem Vergleich der Ultrazentrifugation und der Gelfiltration als Trennmethode zur Isolierung von Lipoproteinklassen und -subklassen. Zum einen wurde vorab isoliertes HDL2 und HDL3 jeweils mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und Gelfiltration subfraktioniert und über Gelelektrophorese und NMR-Spektroskopie untersucht. Um äußere Einflüsse möglichst gering zu halten, wurden dazu Studien über die Wirkung der Konzentration und des pH Wertes auf die Spektrenform durchgeführt. Während der pH-Wert nur einen sehr geringen Effekt zeigte, konnten abhängig von der Konzentration der Probe chemische Verschiebungen und veränderte Diffusionseigenschaften beobachtet werden, so dass die Konzentrationen der HDL Subfraktionen vorsorglich aneinander angeglichen wurden. Es ließ sich schließlich anhand von Diffusionsmessungen zeigen, dass sowohl die molaren Massen als auch die hydrodynamischen Radien der Partikel bezüglich der Separationsmethode differierten und für gelfiltrationsgetrennte Proben auch deutlich kleinere Partikel gefunden wurden. Die chemische Verschiebung hingegen wies für diese Subfraktionen eine geringere Streuung auf als für solche, die mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation separiert wurden.
Auch die präparative Isolierung von Lipoproteinen aus gesamtem Serum wurde durchgeführt und durch NMR-spektroskopische Messungen analysiert. Während mit der sequenziellen Ultrazentrifugation eine klare Lipoproteintrennung erreicht wurde, konnte eine Dichtegradienten-Ultrazentrifugation in einem Schritt weniger dichte Partikel nicht effektiv isolieren. Eine neu entwickelte Methode, die auf der Aneinanderreihung von bis zu fünf Gelfiltrations-Säulen beruht, konnte eine respektable Trennleistung erzielen, jedoch wurden leichte Verunreinigungen durch Lipoproteine anderer Größen detektiert.