Proteincharakterisierung am Beispiel von Apoptosemodulation durch Pockenviren und der Glykosylierung in Insektenzellen
Bartel, Sebastian - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (2012)
Trotz der Ausrottung der humanen Pocken durch die WHO von 1967-1977 sind Pockenviren eine ernste gesundheitliche Gefahr. Die potentielle Bedrohung von Pockenviren als biologischer Kampfstoff als auch die Gefahr von zoonotischen Pockeninfektionen bei Menschen sind Gründe für Untersuchungen der Virus-Wirts-Interaktion. Die Permissivität einer Pockeninfektion ist unabhängig von Oberflächenrezeptoren der Wirtszelle und wird nur durch die Immunantwort der Wirtszelle beeinflusst. Daher wird vor diesem Hindergrund der Einfluss einer Pockeninfektion mit aktiven und UV-inaktivierten Vacciniaviren des Stammes IHD W auf das Proteom von HEK 293 Zellen mittels 2-D Gelelektrophorese und MALDI-ToF MS in einem top-down-Ansatz untersucht.
Hierzu ist eine optimierte Festphasen-basierte Peptidderivatisierungsmethode mit 4 Sulfophenylisothiocyanat (SPITC) an ZipTipµ-C18 Säulen entwickelt worden, um eine hohe Proteinidentifikationsrate durch MS basierte Peptidsequenzierung zu gewährleisten. Das entwickelte Verfahren ermöglicht die Identifizierung der Peptidsequenzen anhand charakteristischer Serien von Y-Ionen und generiert im Vergleich zu bekannten Verfahren in Lösung 7 fach höhere Signalintensitäten und 4-fach höhere Signal/Rausch-Verhältnisse. Innerhalb der Proteome führt die Virusinfektion zu einer Expressionssteigerung von Proteinen, des Energiemetabolismus oder der DNA-Expression, wobei der Einfluss von UV-inaktiviertem und nativem Virus auf die Wirtszelle annähernd identisch ist. Zudem zeigen die Ergebnisse der Untersuchungen eine durch den aktiven Virus initiierte Modulation der Apoptosekaskade. Dies ermöglicht den Schluss, dass für die Zunahme des Energiestoffwechsels und die Veränderung der Proteinbiosynthese vorwiegend Proteine des Viruskapsids verantwortlich sind, welche bereits bei Penetration des Virus in die Zelle vorliegen. Die Modulation der Apoptose als Schutzmechanismus des Virus findet allerdings nur nach Infektion mit nativen Viren statt. Insgesamt ist der infektionsregulatorische Einfluss auf 24 humane Proteine nachgewiesen worden, wobei viele bisher nicht im Kontext einer Pockevireninfektion beschrieben worden sind und zwei Proteine (ATPase family AAA domain containing 3A & 14 kDa cell fusion protein), bisher lediglich auf Transkriptionsebene und durch Homologievergleiche bestätigt sind. Als wichtigste co- und posttranslationale Proteinmodifikation spielt die Glykosylierung eine entscheidende Rolle für die in vivo Aktivität und Verträglichkeit von Proteintherapeutika. Zudem beeinflusst sie die Funktion und Stabilität des entsprechenden Proteins und führt bei ungeeigneter Ausprägung zu Aktivitätsverlusten und allergischen Reaktionen. Die Glykosylierung wird primär durch das Expressionssystem determiniert aber auch Chargenvariationen und Kultivierungsparameter beeinflussen die Art des Glykanmusters. Aus diesem Grund ist die Glykosylierung ein wichtiger Qualitätsparameter, der vor allem bei rekombinanten Proteinen aus nicht humanen Zellsystemen kontrolliert werden muss. In dieser Forschungsarbeit wird das Glykosylierungsmuster von humanem Erythropoietin und humanem Interleukin-4 aus Sf21 Insektenzellen mittels hydrophiler Interaktionschromatographie und MALDI-ToF MS untersucht und mit dem human autologen Glykosylierungsmuster der beiden Proteine verglichen. Zur Überprüfung der erfolgreichen Expression und zur Identifizierung der beiden Proteinkonstrukte erfolgt ein spezifisches Western Blotting gegen die N-termiale His6-Sequenz, sowie ein post-source decay der SPITC-derivatisierten tryptischen Peptide der Konstrukte. Die massenspektrometrische Identifizierung führt zu einer Sequenzabdeckung von 59 % und mascot protein scores von bis zu 159. Die MS Analyse der N Glykosylierungsstellen liefert für rhuEPO eine dreifache Glykosylierung an allen drei Konsensussequenzen N 44, 58 und N 103 sowie für rhuIL-4 eine einfache Glykosylierung an N 58, was jeweils der humanen Glykosylierung entspricht. Die Bestimmung der O Glykosylierung von rhuEPO zeigt einen mucinen Typ I an S 146, der abgesehen von zwei fehlenden Sialinsäuren ebenfalls human autolog ist. Die kombinierte HILIC und MALDI-ToF MS Analyse der durch PNGase F/A abgespaltenen N-Glykane zeigt primär die für Insekten typischen pauci-mannosidischen-Strukturen M3, F(6)M3, M3A1 und F(6)M3A1. In deutlich geringerer Intensität sind auch komplexe sialysierte Strukturen detektierbar. Für rhuEPO können die komplexen N-Glykane F(6)A2G(4)1S(6)1, A2G(4)1S(6)1, F(6)A2G(4)1 und für rhuIL-4 F(6)A3G(4)3S(6)3, A3G(4)3S(6)3, F(6)A3G(4)3S(6)2, A3G3S2, A3G(4)3S(6)1 detektiert werden. Ein Verdau mit PNGase A zeigt keine neuen Strukturen, -(1,3)-Fucosylierung nicht nachgewiesen, so dass keine hoch allergene ist.
Die Ergebnisse zeigen das Potential des Baculoviren-Expressionssystem in Sf21 Zellen komplexe Glykanstrukturen zu produzieren. Einige der detektierten Strukturen sind erstmalig in Insekten nachgewiesen worden.