Charakterisierung von Antikörpern gegen P-12-LOX und Aufbau von Nachweisverfahren (ELISA und Durchflusszytometrie)
Wollmann, Christine - Justus-Liebig-Universität Gießen (2010)
P-12-LOX gehört zur Gruppe der Dioxygenasen und katalysiert die Reaktion von Arachidonsäure zu 12-HETE. P-12-LOX wird bei verschiedenen Krebserkrankungen vermehrt exprimiert. Es liegen Hinweise vor, dass Produkte von P-12-LOX-katalysierten Reaktionen eine Rolle bei Tumorentwicklung, Tumorwachstum und Metastasierung spielen. Bisher gab es keine Möglichkeit, P-12-LOX mit Hilfe eines routinefähigen Verfahrens, z.B. eines ELISA, nachzuweisen. Grund hierfür war das Fehlen eines geeigneten Antikörperpaares für P-12-LOX.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein ELISA-Test zum Nachweis von P-12-LOX in Körperflüssigkeit und Gewebeextrakten entwickelt. Der Test wurde auf seine Eignung für den quantitativen Nachweis von P-12-LOX geprüft. Darüber hinaus wurde untersucht, ob P-12-LOX mittels Durchflusszytometrie in Thrombozyten nachgewiesen werden kann.
Die Spezifität von anti-P-12-LOX Antikörpern wurde detailliert untersucht. Mit Hilfe zweier ausgesuchter Antikörper (polyklonaler Antikörper IgG 7212 und monoklonaler Antikörper 7213 mAb) wurde ein sog. "Sandwich-ELISA" aufgebaut. Der ELISA hat eine ausreichende Sensitivität und Genauigkeit für den Einsatz unter Routinebedingungen. Der ELISA wird durch die Probenmatrix "Plasma" praktisch nicht beeinflusst und kann zur Quantifizierung von P-12-LOX in Plasma eingesetzt werden.
Nach Permeabilisierung mittels Detergenzbehandlung ist es mit den charakterisierten Antikörpern möglich, P-12-LOX in Thrombozyten durchflusszytometrisch nachzuweisen. Der entwickelte ELISA-Test ist eine geeignete routinefähige Methode zum Nachweis von P-12-LOX. Auch die Durchflusszytometrie ermöglicht einen Nachweis von P-12-LOX unter Routinebedingungen. Zusammengefasst erlauben die in der vorgelegten Arbeit beschriebenen Verfahren Untersuchungen zur Rolle von P-12-LOX als Biomarker unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.