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Analysen zur subzellulären Verteilung von Zucker- und Zuckeralkoholtransportern in Arabidopsis thaliana

Wolfenstetter, Susanne - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (2012)


Im Fokus dieser Arbeit stand die Analyse subzellulärer Sortierungsprozesse von Membranproteinen in Mesophyllzellen von A. thaliana. Dazu sollten anhand des tonoplastidären Inosittransporters AtINT1 und des plasmamembranständigen Inosit-transporters AtINT4 spezifische Sortierungssignale innerhalb der Proteinsequenzen und lösliche Adaptorproteine identifiziert werden, die eine gezielte Verteilung der Transporter vermitteln.

Um die Suche nach potentiellen Sortierungssignalen einzugrenzen, wurden zunächst diejenigen Proteindomänen ermittelt, die für eine korrekte Verteilung von AtINT1 und AtINT4 essentiell sind. Hierfür wurden verschiedene zytosolische Bereiche (N-Terminus, Mittelloop, C-Terminus) der Transporter gegeneinander ausgetauscht und anschließend die subzelluläre Lokalisation der resultierenden Chimären und der Wt-Proteine verglichen. Dabei zeigte sich, dass durch den Austausch der C-Termini von AtINT1 und AtINT4 auch ein Wechsel der Zielmembranen bei den Chimärenproteinen herbeigeführt wurde.

Im weiteren Verlauf dieser Arbeit konnte anhand von Sequenzvergleichen mit AtINT1-ähnlichen putativen H+/Inosittransportern aus anderen Pflanzen ein konserviertes Dileucinmotiv des [D/E]XXXL[L/I]-Typs im C-Terminus von AtINT1 identifiziert werden. Gezielte Mutationen des Motivs bewirkten eine Umsortierung des Transporters in die Plasmamembran, wodurch gezeigt wurde, dass dieses Dileucinmotiv ein funktionelles Sortierungssignal darstellt und für die Lokalisation von AtINT1 in der Vakuolenmembran essentiell und ausreichend ist.

Außerdem konnte der C-Terminus von AtINT1 als Werkzeug genutzt werden, um andere Transporter, wie z.B. AtPMT4, AtPMT6, AtSUC2 und AtSWEET1 aus unterschiedlichen Membranen des sekretorischen Systems in die Vakuolenmembran umzusteuern. Hierbei hing die Funktionalität des Sortierungssignals von dessen Abstand zur Transmembran-spanne ab. So wurde gezeigt, dass ein effizientes Umsortieren der chimären Transporter nicht erfolgte, wenn der C-Terminus von AtINT1 an den intakten Transporter angehängt wurde, sondern nur dann, wenn dieser den proteineigenen C-Terminus ersetzte. Allerdings blieb die Aktivität der Transporter trotz ausgetauschter C-Termini erhalten, was anhand von Wachstumsanalysen im heterologen Hefesystem exemplarisch für SUC214/C1 nachgewiesen wurde.

Anders als bei AtINT1 wurde im C-Terminus von AtINT4 überraschenderweise kein Sortierungssignal identifiziert. Vielmehr konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus vollständig deletiert werden kann, ohne die subzelluläre Lokalisation von AtINT4 zu beeinflussen. Aufgrund dieses Ergebnisses und der Beobachtung, dass AtINT1 ohne funktionelles Sortierungssignal in der Plasmamembran lokalisiert ist, wird postuliert, dass die Plasmamembran die Zielmembran des default-Wegs für membranständige Proteine darstellt.

Weiterhin konnte zum ersten Mal direkt eine Funktion des AP-Komplexes 3 (AP-3) bei der subzellulären Verteilung von sekretorischen Proteinen innerhalb der Pflanzenzelle nachgewiesen werden. Anhand von Lokalisationsstudien in ap3 ß-Protoplasten wurde gezeigt, dass AtINT1 auf einem AP-3-unabhängigen Weg an die Vakuolenmembran transportiert wird, während aber ein funktioneller AP-3-Komplex für die korrekte Sortierung des tonoplästidären Saccharosetransporters AtSUC4 essentiell ist. Kolokalisationsstudien von GFP-SUC4 und unterschiedlichen Golgi-Markern zeigten, dass der Transport von AtSUC4 im ap-3 ß-Hintergrund im cis-Golgi blockiert wird, woraus sich schließen lässt, dass dort die Ausbildung AP-3-abhängiger Transportvesikel initiiert wird. Außerdem wurde gezeigt, dass sowohl für die korrekte Verteilung von AtINT1, als auch von AtSUC4 ein intaktes Golgi-Netzwerk erforderlich ist. Demnach existieren in Arabidopsis-Mesophyllzellen zwei unterschiedliche, Golgi-abhängige Transportwege an die Vakuole.

Im Rahmen dieser Arbeit sollte zusätzlich die Funktion des extrazellulären Loops von AtINT2, der die Transmembranspannen IX und X miteinander verbindet (IX/X-Loop), näher untersucht werden. Aus vorangegangenen Arbeiten war bereits bekannt, dass dieser IX/X-Loop mit Nickelionen interagieren kann und dass dadurch die Aktivität des Transporters verloren geht. In der vorliegenden Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass acht konservierte Cysteinreste im IX/X-Loop von AtINT2 für die Interaktion mit Ni++ verantwortlich sind.

Weiterhin wurde gezeigt, dass die vergleichbaren IX/X-Loops von anderen plasmamembranständigen H+/Inosittransportern, wie AtINT4 aus Arabidopsis und hHMIT aus dem Menschen, ebenfalls mit Ni++ interagieren und daraus ein Funktionsverlust der entsprechenden Transporter resultiert.

Zusätzlich konnte erstmals eine funktionelle Charakterisierung des menschlichen Trans-porters hHMIT im heterologen Hefesystem durchgeführt werden. Hierbei wurde hHMIT als funktioneller H+/Inositsymporter mit einem KM-Wert von 0,33 ± 0,01 mM für myo-Inosit beschrieben.


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