Entwicklung und funktionelle Analyse eines zellbasierten Bioaktivitätstests für das Immunzytokin L19-IL2
Winter, Jonas - Freie Universität Berlin (2010)
Gegenwärtig befinden sich viele biopharmazeutische Präparate wie beispielsweise Immunzytokine in der Forschungs- und Entwicklungspipeline pharmazeutischer Unternehmen. Immunzytokine sind bifunktionale Proteine, die aus einem spezifischen Antikörperanteil sowie einem konjugierten Zytokin bestehen.
L19-IL2 stellt ein vielversprechendes Immunzytokin für die Krebstherapie dar und befindet sich derzeit in der klinischen Erprobung. Dieses Protein besteht aus dem humanen scFv Antikörperfragment L19, das spezifisch einen Tumor-assoziierten Bestandteil der extrazellulären Matrix bindet, und humanem Interleukin 2 (IL2), welches zur Stimulation der Immunabwehr in unmittelbarer Umgebung des Tumors führen soll.
In der vorliegenden Arbeit wurde L19-IL2 mit unterschiedlichen, bioanalytischen Methoden charakterisiert. Das Ziel bestand dabei in der Entwicklung eines neuen zellbasierten Bioaktivitätstests, der beide funktionellen Anteile des Immunzytokins berücksichtigt und die aktuellen Anforderungen internationaler Arzneimittel-zulassungsbehörden wie der European Medicines Agency (EMA) oder der US Food and Drug Administration (FDA) erfüllt.
Die Ausgangsbasis für die neue Methode bildete ein klassischer, zellbasierter IL2 Bioaktivitätstest, mit dem ausschließlich die biologische Aktivität des konjugierten IL2 gemessen werden kann. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde darauf aufbauend ein neuer Bioaktivitätstest für L19-IL2 entwickelt, mit dem gleichzeitig die Aktivität des L19 scFv-Anteils und die Fähigkeit des IL2-Anteils, die Proliferation der IL2 abhängigen, zytotoxischen T-Zelllinie CTLL-2 zu induzieren, bestimmt werden kann.
Durch die Validierung des neuen Testformats wurde gezeigt, dass der Test für die Aktivitätsbestimmung von L19-IL2 geeignet ist und eine deutliche Verbesserung verglichen zu anderen Methoden darstellt, die jeweils auf die Analyse einer funktionellen Einheit des Immunzytokins beschränkt sind.
Der Vergleich des neu entwickelten L19-IL2 Bioaktivitätstests mit dem klassischen IL2 Bioaktivitätstest zeigte, dass die Immobilisierung von L19-IL2 durch die Bindung an sein Antigen zu einer verminderten IL2 vermittelten Aktivität im Vergleich zu freiem L19-IL2 führte. Eine Hypothese für die Ursache dafür besteht in der verminderten Induktion der IL2-Signalkaskade aufgrund fehlender oder reduzierter Internalisierung des IL2 Rezeptorkomplexes. Daher wurden die Auswirkungen der Immobilisierung von L19-IL2 auf die Bindung an den IL2-Rezeptor (IL2-R), die Signaltransduktion und die zeitabhängige Internalisierung des IL2 Rezeptorkomplexes mittels Western Blot und konfokaler Laserscanning Mikroskopie (CLSM) untersucht. Der Nachweis von phosphoryliertem STAT5 zeigte, dass auch immobilisiertes L19-IL2 den JAK-STAT Signalweg induziert. Die CLSM-Studien ergaben jedoch, dass die Immobilisierung von L19-IL2 tatsächlich zu einer verringerten Internalisierung führte und unterstützten damit die Hypothese.