Massenspektrometrische Analyse von enzymatisch-chemischen Verdaus zur Detektion von Photoaffinitätsmarkierungen des ABC-Transporters P-Glykoprotein
Wieschrath, Svenja - Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn (2015)
Der ATP-binding cassette (ABC) Transporter P-Glykoprotein (P-gp) stellt den aus medizinischer Sicht wichtigsten humanen ABC-Transporter dar. Aufgrund seiner ubiquitären Expression in Geweben mit Barrierefunktion und ausgeprägten Polyspezifität, hat das Transportprotein großen Einfluss auf die Pharmakokinetik vieler auf dem Markt oder in der Entwicklungsphase befindlichen Arzneistoffe und ist darüber hinaus am Phänomen der klassischen Multidrug Resistenz (MDR) beteiligt. Trotz jahrelanger intensiver Forschung konnte die Funktionsweise des Proteins bisher nicht abschließend geklärt werden und vor dem Hintergrund des äußerst breiten Substratspektrums stellt sich die Frage nach der Art, Anzahl, Lokalisation und Spezifität der Bindungsstellen. In einer Vielzahl von Untersuchungen wurde die Existenz mehrerer Bindungsstellen für verschiedene Liganden postuliert, jedoch konnte bis heute nicht aufgeklärt werden, ob die verschiedenen Bindungsstellen als bevorzugte, teils benachbarte oder überlappende Erkennungsregionen innerhalb einer großen Bindungstasche realisiert sind oder als separate, räumlich getrennte Bindungsstellen vorliegen. Der Kerninhalt der Dissertation sollte daher aus der Charakterisierung potenzieller Bindungsstellen für ausgewählte photoaktivierbare P-gp-Modulatoren mit Hilfe einer Kombination aus Photoaffinitätsmarkierung, enzymatischem Verdau und massenspektrometrischer Analyse von P-gp bestehen.
Die Voraussetzung für die Durchführbarkeit erfolgreicher Photoaffinitätsmarkierungs-Experimente ist eine möglichst vollständige Abdeckung der Aminosäuresequenz von P-gp. Um dieses Ziel zu erreichen wurden in der Dissertation die Enzyme Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Elastase, Proteinase K und Thermolysin neben dem chemischen Agens Bromcyan separat oder in Kombination für den Verdau von P-gp eingesetzt und im Hinblick auf ihre Spaltungsspezifität und -effizienz gegenüber P-gp charakterisiert. Verdautechnisch wurden hierbei sowohl In-Gel- als auch In-Lösung-Verdaus durchgeführt. Darüber hinaus wurden einige der genannten Spaltungsreagenzien mit Hitzedenaturierung oder mit der Massenspektrometrie kompatiblen Detergenzien kombiniert und bezüglich ihres Einflusses auf die Sequenzabdeckung von P-gp untersucht. Nach Abschluss der Verdau-Experimente wurden Photoaffinitätsmarkierungen von P-gp mit den Photoliganden 8-Azido-ATP, 2,4-Dihydroxybenzophenon, H15 und H19 unternommen.
Die Auswertung der Verdau-Experimente ergab, dass mit den In-Lösung-Verdaus von P-gp im Vergleich zu den entsprechenden In-Gel-Verdaus wesentlich höhere Sequenzabdeckungen erzielt werden konnten. Die beste Sequenzabdeckung der Loop- und Linker-Regionen sowie der Nukleotid-Bindungsdomänen wurde mit Hilfe des Trypsin-In-Lösung-Verdaus erreicht, die höchste Sequenzabdeckung in den transmembranären Helices mit dem Pepsin-In-Lösung-Verdau bzw. der Kombination aus Chymotrypsin-In-Lösung-Verdau und dem anionischen Detergens AALS II. Durch die In-Lösung-Verdaus von P-gp mit Chymotrypsin, Bromcyan, Pepsin, Elastase, Proteinase K und Thermolysin konnte in allen Fällen eine Verbesserung der Sequenzabdeckung in den transmembranären Domänen verzeichnet werden. Der Einsatz von Hitzedenaturierung und mit der Massenspektrometrie kompatiblen Detergenzien führte zu einer deutlichen Erhöhung der Sequenzabdeckung, insbesondere in den transmembranären Bereichen von P-gp. Im Zuge der Photoaffinitätsmarkierungs-Experimente konnten die in der Literatur beschriebenen Bindungsstellen von P-gp für den Photoliganden 8-Azido-ATP bestätigt und für das Photolabel 2,4-Dihydroxybenzophenon sogar noch erweitert werden. Darüber hinaus konnten im Rahmen der Photolabeling-Experimente mit H15 und H19 weitere potenzielle Bindungsregionen innerhalb von P-gp aufgezeigt werden.