Methodenoptimierung für den automatisierten "On-Membrane-Digest" nach Western Blot
Wagner, Anne Christine - Justus-Liebig-Universität Gießen (2010)
Ein wichtiger Bestandteil der Proteomik ist die Identifizierung exprimierter Proteine und die Analyse der Proteome von Zellen, Organellen und ganzen Organismen. Diese Methoden werden z.B. bei der Untersuchung von Krankheitserregern oder pathologischen Veränderungen in der medizinischen Forschung eingesetzt. Die 2D-Gelelektrophorese mit anschließendem In-Gel-Verdau in Kombination mit der Massenspektrometrie stellt neben LC-basierenden Methoden eine der bisher besten Möglichkeiten dar, Proteine zuverlässig zu identifizieren.
In dieser Arbeit wurde eine automatisierte Methode entwickelt, nach der 2DGelelektrophorese und dem Transfer der Proteine auf NC- bzw. PVDF-Membranen den proteolytischen Verdau auf der Blot-Membran zu ermöglichen.
Zur Detektion der Proteine auf den Membranen wurden diese mit dem Farbstoff Direct Blue 71 angefärbt. Anschließend konnten die Spots aus den Membranen ausgeschnitten und dem automatisierten Verdau zugeführt werden. Ein Großteil dieser Arbeit bestand darin, den automatischen On-Membrane-Verdau hinsichtlich der nachfolgenden massenspektrometrischen Identifizierung der Proteine durch Peptide-Mass-Fingerprint-Analysen zu optimieren, indem Parameter wie Verdauzeit, Zusammensetzung der Extraktionslösung, Zugabe von Octylglycosid zu den Verdaupuffern und Trypsinmenge variiert wurden.
Diese Methode wurde dann für die Analyse von Proteinen nach vorangegangenem Western Blot und Immunodetektion per ECL weiterentwickelt. Hier war die Entwicklung einer effizienten Waschmethode zur Entfernung des Blockierungsreagenzes Roti-Block von entscheidender Bedeutung.
Nach dem automatischen Verdau wurden die Verdauextrakte nach geeigneter Matrixpräparation auf einen MS-Probenträger aufgetragen und der MS-Analyse zugeführt. In diesem Teil der Arbeit wurden die Proteinidentifizierungen mittels dreier verschiedener Matrices verglichen: HCCA-Matrix nach Jahn, DHB/HCCA-Mischmatrix und DHB/H3PO4-Matrix. Hierbei stellte sich heraus, dass Matrices unterschiedlich stark auf Kontaminationen aus dem Western-Blot Prozess reagieren. So stört das Blockierungsreagenz Roti-Block die Messung mit HCCA-haltigen Matrices erheblich.
Die Entwicklung dieser automatisierten Verdaumethode direkt von Western Blot-Membranen ermöglicht nun mit minimiertem manuellem Aufwand die Identifizierung von Proteinen aus komplexen Proteinproben heraus direkt von Western Blot-Membranen nach immunologischer Detektion und wird zukünftig derartige Analysen deutlich erleichtern.