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Positionsspezifischer Nachweis und relative Quantifizierung von Modifikationen des alpha-s1-Caseins in Milch mittels MALDI-TOF-MS

Vollmer, Gregor - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (2012)


Milch und Milchprodukte spielen eine bedeutende Rolle in der menschlichen Ernährung. Vor der Abgabe an den Verbraucher wird Milch in den allermeisten Fällen hitzebehandelt, um mikrobielle Stabilität sicherzustellen und die Haltbarkeit zu verlängern. Allerdings kann diese Hitzebehandlung die in Milch enthaltenen Nährstoffe, unter anderem Kohlenhydrate, Lipide, Proteine und Vitamine, erheblich schädigen. Vitamine werden durch starke Erhitzung zerstört, bei den Lipiden kann es zu Abbaureaktionen kommen; Proteine können oxidiert werden, denaturieren oder Quervernetzungen ausbilden. Aus dem Milchzucker Lactose können beispielsweise reaktive Dicarbonyle entstehen.

Eine wichtige bei der Erhitzung von Milch auftretende Reaktion läuft zwischen der Lactose und den Milchproteinen ab. Diese sogenannte Maillard-Reaktion führt zu einer großen Vielfalt unterschiedlicher Produkte. Das erste stabile Zwischenprodukt, das im Zuge dieser Reaktion gebildet wird, ist das Amadoriprodukt. Dieses entsteht, wenn ein Lactosemolekül an eine e-Aminogruppe eines Lysinrests oder an den N-Terminus eines Proteins gebunden wird. Dauert die Erhitzung länger an, so bilden sich diverse weitere Produkte, von Carboxymethyllysin (CML) bis hin zu komplexen, stickstoffhaltigen und teilweise braun gefärbten Strukturen (Melanoidinen). Diese späten Reaktionsprodukte werden AGEs genannt. Eine weitere Folge der Maillard-Reaktion ist die Abnahme der biologischen Wertigkeit von Nahrungsproteinen, da der Anteil an bioverfügbarem Lysin, einer essentiellen Aminosäure, gesenkt wird. Daher ist es von großer Bedeutung, industrielle Erhitzungsprozesse zu optimieren, um die Bildung von Maillard-Produkten und damit den Lysinverlust zu minimieren. Ein besonderes Milchprodukt ist Kindermilchnahrung, die speziell für die Ernährung von Säuglingen geeignet ist. Diese Produkte basieren auf Kuhmilch, werden jedoch durch Zusatz von unter anderem Molkenproteinen und Lactose an Muttermilch angeglichen. Anschließend werden sie intensiv hitzebehandelt, um die Kleinkinder nicht zu gefährden. Hier wiegt der Verlust an der essentiellen Aminosäure Lysin besonders schwer, da Säuglinge einen möglichen Mangel im Unterschied zu Erwachsenen nicht durch eine ausgewogene Ernährung kompensieren können. Der Fokus dieser Dissertation lag auf dem Nachweis von Maillard-Produkten und oxidativen Veränderungen der Milchproteine. Ziel war, in Abhängigkeit der Intensität einer Erhitzung das Ausmaß der Schädigungen eines Milchproteins zu verfolgen. Untersucht wurde hier as1-Casein, das von allen Milchproteinen am häufigsten vorkommende Protein. Gleichzeitig wurde bestimmt, welche Aminosäurereste von as1-Casein, b-Casein und a-Lactalbumin reaktiv sind und es wurden die Modifikationen identifiziert, die am häufigsten auftreten.

Als Nachweistechnik wurde hier MALDI-TOF-Massenspektrometrie eingesetzt. Um die genaue Modifikationsstelle bestimmen zu können, wurden die untersuchten Proteine im Vorfeld enzymatisch durch Endoproteasen partiell verdaut. Für die Caseine hat sich herausgestellt, dass die Endoprotease GluC das am besten geeignete Verdauenzym ist. Die Identifikation des Modifikationstyps erfolgte über die Massendifferenz zwischen den Signalen eines nativen Peptids und des gleichen Peptids mit Modifikation. b-Casein wurde gelelektrophoretisch aus UHT-Milch isoliert, im Gel mit GluC verdaut und mittels MALDI-TOF-MS vermessen. Es konnten alle erwarteten nativen Peptide detektiert werden, ebenso wie die Lactosylierung von Lys113 und zwei Oxidationen von Methionin zu Methioninsulfoxid (Met93 und Met109). Unter Anwendung dieser Methode konnten keine weiteren Modifikationen nachgewiesen werden; auch eine zusätzliche Hitzebehandlung der UHT-Milch vor der Untersuchung führte nicht zum Nachweis weiterer Modifikationen. Ebenso konnten bei der Untersuchung von as1-Casein nur einige wenige Modifikationen detektiert werden.

Deshalb wurde durch eine chromatografische Auftrennung und Fraktionierung der beim Verdau erhaltenen Peptidmischung die Empfindlichkeit verbessert. Dazu wurde eine HPLC-Methode etabliert, die die Trennung der Peptide aus dem Hydrolysat von as1-Casein ermöglicht; ebenso wurde je eine weitere Methode für die Auftrennung der Peptide aus den Hydrolysaten von b-Casein und a-Lactalbumin entwickelt. Die Peptide wurden in mehreren Fraktionen aufgefangen, gefriergetrocknet und anschließend mittels MALDI-TOF-MS vermessen. Dabei zeigte sich ein relativ großer Einfluss der verwendeten Matrix, weshalb für jede as1-Casein-Fraktion individuell die optimal geeignete Matrix identifiziert und im Folgenden eingesetzt wurde. Auf diese Weise wurde zunächst das Milchprotein a-Lactalbumin untersucht, nachdem es in einem Milchmodellsystem mit Lactose inkubiert worden war. Nach Erhitzung des Proteins für 14 Tage bei 60 °C mit Lactose in milchtypischen Konzentrationen wurde es mit AspN verdaut, die Peptidmischung chromatografisch aufgetrennt, fraktioniert und mittels MALDI-TOF-MS vermessen. So konnten Amadoriprodukte an N-Terminus/Lys5, Lys58/Lys62, Lys79, Lys93/Lys94 und Lys98/Lys108/Lys114 nachgewiesen werden. Allerdings können mit dieser Methode einzelne Lysinreste, die nach der enzymatischen Hydrolyse im gleichen Peptid lokalisiert sind, nicht unterschieden werden. Die Modifikationen stehen in guter Übereinstimmung mit Literaturdaten. An den gleichen Positionen (außer Lys93/Lys94) konnten CML-Modifikationen nachgewiesen werden, des Weiteren wurden die Oxidationen von Trp60/Cys61, Met90/Cys91, Trp104/Cys111 und Trp118/Cys120 detektiert. Ebenso wurde im Milchmodellsystem mit Lactose für 14 Tage bei 60 °C erhitztes as1-Casein untersucht; es konnten an jeweils mehreren Peptiden das Amadoriprodukt und CML nachgewiesen werden, zusätzlich drei oxidierte Peptide (Positionen siehe unten). Im Anschluss sollte aus Milchproben isoliertes as1-Casein vermessen werden. Zuerst wurde die erforderliche Trennung der Milchproteine durch Gelelektrophorese realisiert, gefolgt von einem In-Gel-Verdau. Wie sich allerdings zeigte, konnten auf diese Weise deutlich weniger Modifikationen des as1-Caseins nachgewiesen werden als bei der Erhitzung im Milchmodellsystem; im Einzelnen die drei oxidierten Peptide und zwei Lactosylierungen. Daher wurde eine Trennung der Milchproteine mittels HPLC etabliert. Durch diese Verbesserung konnte die Anzahl der erfassten modifizierten Peptide deutlich erhöht werden, was möglicherweise dadurch erklärt werden kann, dass die Elution der Peptide aus dem Gel zu größeren Verlusten geführt hat. Mit dieser hier etablierten Methode wurden anschließend diverse Milchproben vermessen: Bei 60 °C und bei 99 °C hitzeinkubierte Rohmilch, bei 60 °C inkubierter a-Casein-Standard sowie Handelsproben von Rohmilch, UHT-Milch, Sterilmilch und Kindermilchnahrungen. Alle Proben wurden zuerst entfettet, dann wurde mittels HPLC as1-Casein isoliert und dieses mit GluC verdaut. Die resultierende Peptidmischung wurde an der HPLC fraktioniert und die einzelnen Fraktionen wurden mittels MALDI-TOF-MS vermessen. Diese Methode ergab eine Sequenzabdeckung von 84% bei as1-Casein; es wurden 13 der 14 vorhandenen Lysinreste abgedeckt, ebenso beide Tryptophanreste und vier der fünf Methioninreste. An Modifikationen konnten einfach und zweifach oxidierte Peptide, CML und das einfache und zweifache Amadoriprodukt nachgewiesen werden; bei letzterem ist je ein Lactulosylrest an zwei Lysinreste eines Peptids (oder an einen Lysinrest und den N-Terminus des Proteins) gebunden.

In as1-Casein wurden Amadoriprodukte an den Positionen N-Terminus/Lys3/Lys7, Lys34/Lys36, Lys79/Lys83, Lys102/Lys103/Lys105, Lys124, Lys132 und Lys193 nachgewiesen, das zweifache Amadoriprodukt und CML jeweils an N-Terminus/Lys3/Lys7, Lys102/Lys103/Lys105 und Lys79/Lys83. Einfache Oxidation zeigten Met123, Met135 und Met196/Trp199, zweifache Oxidation nur Met123 und Met196/Trp199. Während die Oxidationsprodukte in fast allen Proben detektiert wurden, waren die Amadoriprodukte sowie die CML-Modifikationen abhängig vom Peptid erst nach einer bestimmten Erhitzungszeit nachweisbar. Beispielsweise wurde CML an Lys79/Lys83 erst nach Inkubation von Rohmilch für sieben Tage bei 60 °C nachweisbar, das zweifache Amadoriprodukt bereits nach Inkubation für vier Tage.

Die Messdaten ermöglichten neben dem qualitativen Nachweis von Modifikationen auch die relative Quantifizierung der Hauptmodifikationen des as1-Caseins. Die dabei eingesetzte Modifikationsrate wurde folgendermaßen errechnet: Die Signalintensität des Peaks einer Modifikation wurde geteilt durch die Summe der Signalintensitäten der Peaks des nativen Peptids und aller zugehöriger Modifikationen. Bei der relativen Quantifizierung der Modifikationen des as1-Caseins aus bei 60 °C für 0, 1, 4, 7 und 14 Tage erhitzter Rohmilch ergaben sich je nach Peptid und Modifikation sehr unterschiedliche Verläufe der einzelnen Modifikationsraten. Bei einigen Peptiden nahm die Modifikationsrate des Amadoriprodukts während der gesamten Erhitzung zu, bis auf Werte von etwa 2% an Lys34/Lys36 und bis 13% an Lys102/Lys103/Lys105. Bei anderen Peptiden nahm sie erst zu, bis auf 40% an N-Terminus/Lys3/Lys7, und anschließend bei weiter andauernder Erhitzung wieder ab. Ein Grund dafür könnte die Bildung von CML, einem Abbauprodukt des Amadoriprodukts, sein; hier ergab sich bei allen modifizierten Peptiden ein Anstieg der Modifikationsrate, auf 0,5% an Lys79/Lys83 bis zu 7% an N-Terminus/Lys3/Lys7. Das zweifache Amadoriprodukt zeigte auf etwa 2% ansteigende Modifikationsraten, konnte aber nur an zwei Peptiden relativ quantifiziert werden. Die Modifikationsraten der einfachen Oxidation erreichten peptidabhängig 7% bis 33 %, die der zweifachen Oxidation bis zu 3 %.

Die Erhitzung von Rohmilch bei 99 °C für 0 und 20 Minuten sowie 1, 2, 5 und 10 Stunden wurde in unabhängiger Dreifachbestimmung durchgeführt. Es ergaben sich Kurvenverläufe, die den oben genannten sehr ähnlich waren. Während auch hier die Modifikationsrate des Amadoriprodukts mancher Peptide anstieg (auf Werte bis zu 9 %), zeigte sie bei anderen Peptiden ein Maximum von bis zu 36% nach zwei bzw. fünf Stunden Erhitzung, abhängig vom jeweiligen Peptid. Für CML wurden auf bis zu 13% (an N-Terminus/Lys3/Lys7) zunehmende Modifikationsraten bestimmt. Die Werte des zweifachen Amadoriprodukts lagen wiederum bei maximal etwa 2 %, jedoch war diese Modifikation nach 10 Stunden Erhitzung nicht mehr quantifizierbar. Die einfache Oxidation ergab steigende Modifikationsraten auf bis zu etwa 61% an Met123, die Modifikationsrate der zweifachen Oxidation erreichte etwa 6% an Met196/Trp199. Anschließend wurde as1-Casein aus Handelsproben untersucht. Die Modifikationsraten des Amadoriprodukts stiegen bei allen Peptiden von Rohmilch über UHT-Milch bis zur Sterilmilch an. In Rohmilch betrug die maximale Modifikationsrate 0,2% an N-Terminus/Lys3/Lys7, bei UHT-Milch 13 %, in Sterilmilch 24 %. Das zweifache Amadoriprodukt und CML konnten nur in manchen Sterilmilchproben an einzelnen Peptiden relativ quantifiziert werden, die Gehalte lagen unter 1,5 %. Die Mediane der Modifikationsraten der einfachen Oxidation lagen proben- und peptidabhängig zwischen 2% und 30 %, die der zweifachen Oxidation unter 12 %.

Bei den Kindermilchnahrungen wies das Amadoriprodukt Modifikationsraten bis zu 26% auf. Auch hier ergaben das zweifache Amadoriprodukt und CML nur in manchen Proben und an einzelnen Peptiden quantifizierbare Werte; diese lagen unterhalb von 1,3 %. Diese Ergebnisse liegen ebenso wie die der einfachen und zweifachen Oxidation in dem Bereich, in dem die Werte der erhitzten Rohmilchproben liegen. Das zeigt, dass die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Erhitzungsserien von Rohmilch ein gutes Modell für die industrielle Erhitzung darstellen.

Einige der untersuchten Peptide enthalten mehrere mögliche Modifikationsstellen, deren Unterscheidung durch Vermessung mittels MALDI-TOF-MS nicht möglich ist. Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, welche dieser Positionen tatsächlich modifiziert sind. Dazu wurde ein Tandem-Massenspektrometer eingesetzt, das eine Sequenzierung von Peptiden erlaubt. Es wurde für 2 Stunden bei 99 °C hitzebehandelte Rohmilch mit GluC verdaut und die Peptidmischung mittels UHPLC-MS/MS vermessen. Es wurde ein EPI-Scan (Enhanced Product Ion Scan) durchgeführt, wobei als Vorläuferionen mehrfach geladene modifizierte Peptide ausgewählt wurden. Anhand von b- und y-Serien in den resultierenden Fragmentspektren konnte gezeigt werden, dass in dem Peptid, das Met196 und Trp199 enthält, nur der Tryptophanrest zweifach oxidiert vorliegt, die einfache Oxidation jedoch am Methioninrest lokalisiert ist. Bereits gezeigt wurden die Methioninoxidationen von Met123 und Met135 zum Methioninsulfoxid und von Met123 zum Methioninsulfon. Zusätzlich zu den oben genannten Aminosäuren konnte ein Amadoriprodukt an Lys58 nachgewiesen werden. Anhand weiterer Untersuchungen konnte abschließend die Lactosylierung des N-Terminus und von Lys7, Lys34, Lys36, Lys58, Lys79/Lys83, Lys102, Lys105, Lys124, Lys132 und Lys193 in as1-Casein nachgewiesen werden.

Als wichtigste Modifikationen des as1-Caseins in thermisch behandelter Milch wurden das Amadoriprodukt, CML sowie Oxidationsprodukte von Methionin und Tryptophan identifiziert. Alle Modifikationen wurden positionsspezifisch relativ quantifiziert. Damit erlaubt die Methode, struktur- und positionsspezifische Reaktionskinetiken zu erstellen. Solche Erkenntnisse können dazu beitragen, Parameter einer industriellen Erhitzung weiter zu optimieren.


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