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Weiterentwicklung und Evaluierung eines DNS-Microarrays zur Identifikation von humanpathogenen Pilzen

Strandhagen, Ulrike - Eberhard Karls Universität Tübingen (2010)


Invasive Mykosen stellen eine wachsende Gefahr, insbesondere für immunsupprimierte Patienten, dar. Dabei hängt die Prognose wesentlich von einer umgehend eingeleiteten spezifischen Therapie auf der Basis einer schnellen und präzisen Diagnose ab. Die bisherigen diagnostischen Methoden sind jedoch zeitaufwendig und die Ergebnisse oft zu unspezifisch.

Der 2004 am ITB Stuttgart entwickelte Oligonukleotid-Microarray zur Detektion von humanpathogenen Pilzen (Leinberger, 2004) ist in der Lage, ausgewählte Candida- und Aspergillusspezies schnell und zuverlässig zu identifizieren. In der vorliegenden Arbeit wurde dieses System von 12 Spezies aus 2 Gruppen auf 40 Spezies aus 15 Gruppen erweitert. Ein besonderer Schwerpunkt lag dabei auf den klinisch immer bedeutsamer werdenden Zygomyceten, von denen folgende Vertreter aufgenommen wurden: Absidia corymbifera und Absidia glauca, Mucor hiemalis, Rhizomucor pusillus, und Rhizopus oryzae. Für die DNS Extraktion aus den Pilzzellen wurde ein neues Protokoll verwendet, dass die Arbeitszeit von vier auf eine Stunde verkürzte. Das Extraktionsergebnis wurde dadurch nicht beeinträchtigt: Aus allen Spezies konnte DNS in ausreichender Menge isoliert werden.

Um den optimalen Versuchsaufbau zu finden, wurden alle wichtigen Größen variiert: das PCR-Kit, die Konzentration der Hybridisierungspuffer SSPE und SDS, die Hybridisierungstemperatur und die Vorbereitung der DNS auf die Hybridisierung durch Denaturierung oder Fragmentierung. Aufgrund der Ergebnisse dieser Versuche wurden folgende Standardbedingungen für diese Arbeit formuliert: Die Markierungs- und Amplifizierungs-PCR wurde mit der Taq DNA-Polymerase (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) durchgeführt. Anschließend wurde das PCR Produkt aufgereinigt, denaturiert und bei 53°C für zwei Stunden hybridisiert. Der Microarray wurde mit Referenzstämmen für alle Zielspezies und zusätzlich 48 klinischen Isolaten validiert. Dabei wurden alle Zielspezies auf Speziesebene identifiziert. War das Isolat keine Zielspezies aber aus einer Zielgruppe des Microarrays, so wurde es auf Gruppenebene erkannt. Nicht-Zielspezies erzeugten keine relevanten Kreuzhybridisierungen. Durch die Einführung der Tiefseehefe Rhodosporidium sphaerocarpum als internem Standard ist es möglich geworden, Mischungen zu identifizieren, relative Signale der einzelnen Spezies zu berechnen und eine näherungsweise Aussage über das Mischungsverhältnis zu treffen. Die Versuche zur Sensitivität des Microarrays zeigten, dass er in der Lage ist, DNS in der Menge von zehn Genomen zu detektieren.

Eine weitere Validierung des Systems mit Blut- oder Gewebeproben war im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich. Dennoch hat sich der Microarray durch die Ergebnisse dieser und anderer Arbeiten (Leinberger, 2004; Hsiao, 2005; Huang, 2006) als zuverlässige, schnelle und anpassungsfähige Methode für die mykologische Diagnostik empfohlen.


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