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Strukturelle Analyse der dynamischen Konformationsänderung des Prion-Proteins in Proteinmissfaltungskrankheiten

Sommer, Anne - Universität Hamburg (2015)


Prion-Proteine können durch eine Konformationsänderung, die beispielsweise oxidativ induziert werden kann, in ihre β-Faltblatt-reiche pathogene Isoform umgewandelt werden, welche als alleiniger Erreger der übertragbaren spongiformen Enzephalopathien angesehen wird. Eine hochauflösende Struktur der PrPSc-Isoform sowie detaillierte Kenntnisse über den Mechanismus der Umwandlung und deren Initialisierung sind bis heute nicht vorhanden, obwohl die Forschung auf diesem Gebiet sehr umfangreich ist.

Zur Gewinnung neuer Erkenntnisse wurde im Rahmen dieser Arbeit zunächst die Herstellung der Prion-Proteine optimiert, daraufhin ein UV-System zur oxidativ-induzierten Konformationsänderung etabliert und die Radienbestimmung von Proteinen mittels DLSSystem im Fluss untersucht. Während der UV-Bestrahlungsexperimente konnten neben der Bildung einer löslichen, oligomeren Spezies Aggregations-Intermediate detektiert werden, deren Herstellung für weitere Isolierungs- und Charakterisierungsexperimente optimiert wurde. Die Produktion der gewünschten Aggregations-Intermediate mittels UV-Bestrahlung war sowohl im Kreislaufsystem als auch im Durchflusssystem erfolgreich. Die anschließende Isolierung der hergestellten Spezies von den PrP-Monomeren unter Anwendung verschiedener biochemischer Trennmethoden blieb jedoch erfolglos, daher erfolgte die Charakterisierung mit den bestrahlten Mischfraktionen. Die Proben wurden mittels DLS, CD-Spektroskopie und nativer PAGE analysiert, dabei wurde deutlich, dass es sich bei den hergestellten AggregationsIntermediaten nicht um "dimere" und "trimere" Zwischenstufen handelt. Es konnte gezeigt werden, dass in der Proteinlösung nicht nur die in der SDS-PAGE-Analyse detektierten spezifischen Zwischenprodukte vorlagen und dass die erzeugten Spezies bereits diffuse oligomere Strukturen aufwiesen. Mit zunehmender Bestrahlungszeit und der Bildung höherer Aggregate entsprach der charakteristische Faltungszustand der Prion-Proteine nicht mehr dem der zellulären Form des Prion-Proteins. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die oxidativ-induzierte spezifische Umwandlung des Prion-Proteins nicht über einzelne spezifische Zwischenzustände verläuft, sondern von Anfang an diffuse oligomere Zustände aufweist, welche im weiteren Verlauf der oxidativen Schädigung kovalente Vernetzungen ausbilden und schließlich die löslichen, spezifischen Oligomere formen. Des Weiteren konnte die Inhibition der PrP-Aggregation durch spezifische Peptide nachgewiesen werden. Der inhibitorische Effekt konnte sowohl in einem etablierten oxidativen metallkatalysierten Assay als auch durch das UV-induzierte Umwandlungssystem bestätigt werden. Die Ergebnisse der CD-spektroskopischen Analysen deuten darauf hin, dass die vielversprechendsten Peptide das Prion-Protein in der zellulären, vorwiegend α-helikalen Form stabilisieren und dabei eine hohe Bindungsaffinität im µM-Bereich aufweisen. Diese Resultate müssen zukünftig verifiziert und vertieft werden, um detailliertere Erkenntnisse einerseits über den molekularen Ablauf des UV-induzierten Umwandlungsmechanismus von der zellulären Form des Prion-Proteins in seine pathogene Isoform und andererseits über die Bindung der inhibierenden Peptide als Grundlage zur Entwicklung eines Medikaments für Prionen-Erkrankungen zu liefern. Abschließend lässt sich festhalten, dass wichtige neue Einblicke in den UV-induzierten Umwandlungs- und Aggregationsmechanismus des Prion-Proteins gewonnen wurden und außerdem noch neue, vielversprechende Peptide identifiziert wurden, die möglicherweise zu effektiven PrP-Umwandlungsinhibitoren optimiert werden können.


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