Untersuchung der Dynamik von Mitochondrien mit licht- und elektronenmikroskopischen Methoden
Scholz, Dirk - Universität Bayreuth (2015)
Mitochondrien sind hochdynamische Organellen, die in vielen verschiedenen Zelltypen regelmäßig miteinander fusionieren und geteilt werden. Die Bäckerhefe S. cerevisiae ist ein idealer Modellorganismus, welcher sehr gut für die Untersuchung der mitochondrialen Dynamik geeignet ist. Durch die Verwendung moderner licht- und elektronenmikroskopischer Methoden wurden in dieser Arbeit verschiedene Aspekte der mitochondrialen Dynamik in S. cerevisiae untersucht.
Nach Herstellung einer Sammlung verschiedener mitochondrialer Markerplasmide konnte mit Hilfe des photokonvertierbaren Fluoreszenzproteins Dendra2 ein Assay etabliert werden, der es ermöglicht, die Dynamik individueller Mitochondrien innerhalb einer Zelle spezifisch zu verfolgen. Das Dynamin-verwandte Protein Dnm1 ist in S. cerevisiae die Schlüsselkomponente der mitochondrialen Teilung. Es ist jedoch nicht bekannt, ob Dnm1 ausschließlich die Teilung der mitochondrialen Außenmembran vermittelt oder es ebenfalls für die Teilung der mitochondrialen Innenmembran verantwortlich ist. Proteine, welche die Teilung der mitochondrialen Innenmembran vermitteln, sind bisher unbekannt.
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob Dnm1 möglicherweise an der Teilung der mitochondrialen Innenmembran beteiligt ist. In Kombination mit fluoreszenzmarkierten Dnm1-Varianten konnte mittels Photokonversionsassay gezeigt werden, dass an den Assemblierungspunkten von Dnm1 und Dnm1G185S eine Diskontinuität innerhalb der mitochondrialen Matrix vorhanden ist. Bei ultrastrukturellen Analysen möglicher Dnm1-Bindestellen wurden gegenüberliegende Cristae oder getrennte Innenmembranen an Einschnürungen der mitochondrialen Außenmembran beobachtet. Diese Beobachtungen sind Hinweise für einen koordinierten Ablauf bei der Teilung von mitochondrialer Innen- und Außenmembran.
In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde die Num1-vermittelte Verankerung der Mitochondrien untersucht. Num1 ist ein 313 kDa großes, kortikales Protein, welches eine wichtige Rolle bei der Migration des Zellkerns spielt und an der Verankerung der Mitochondrien am Zellkortex der Mutterzelle beteiligt ist. Elektronentomographische Untersuchungen der mitochondrialen Verankerungsstellen am Zellkortex zeigten Einstülpungen der Plasmamembran, welche direkte Kontakte zur mitochondrialen Außenmembran bildeten. Dementsprechend erfolgt die Befestigung der Mitochondrien in der Mutterzelle vermutlich über Kontakte mit der Plasmamembran. Die hier beschriebenen Einstülpungen der Plasmamembran an den mitochondrialen Verankerungsstellen zeigten eine auffallende Ähnlichkeit zu den Membraneinstülpungen, welche durch große, heterodimere, unbewegliche Proteinkomplexe an der Plasmamembran, sogenannte Eisosomen, gebildet werden. Ein unmittelbarer Zusammenhang zu den durch Eisosomen gebildeten Membraninvaginationen konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Während in S. cerevisiae und Säugetieren die mitochondriale Dynamik sehr gut untersucht und detailliert beschrieben wurde, ist über die mitochondriale Fusion in Algen und höheren Pflanzen nur sehr wenig bekannt. Um die Fusion von Mitochondrien in der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii nachzuweisen, wurden die Mitochondrien von Gameten unterschiedlichen Paarungstyps mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt. Die Durchmischung der Fluoreszenzfarbstoffe in den Zygoten zeigte die mitochondriale Fusion. Die Fusion der Mitochondrien konnte in Wildtypzygoten und mit geringerer Effizienz in Zygoten von respiratorischen Mutanten nachgewiesen werden. Daraus wird geschlussfolgert, dass Mitochondrien regelmäßig in Chlamydomonas reinhardtii fusionieren.