Entwicklung von Nachweismethoden für Lysozym und Nisin in Milchprodukten
Schneider, Nadine - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (2011)
Die beiden antibakteriell wirksamen Substanzen Lysozym und Nisin wirken gegen grampositive Bakterien und können als Konservierungsstoffe für Käse eingesetzt werden. Dadurch kann die Spätblähung des Käses, verursacht durch das Bakterium Clostridium tyrobutyricum verhindert werden. Daneben wirken diese Konservierungsstoffe aber auch gegen andere grampositive Verderbnis- und/oder Krankheitserreger, wie z. B. den pathogenen Keim Listeria monocytogenes. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von Nachweis- und Quantifizierungsmethoden für die beiden Konservierungsstoffe. Dabei sollten die Methoden für die Detektion in der Käsematrix optimiert werden. Weiterhin sollten die Nachweismethoden als Routinemethoden in der staatlichen Lebensmittelüberwachung geeignet sein.
Unter Verwendung eines monoklonalen, kommerziell erhältlichen anti-Lysozym Antikörpers wurde ein indirekter, kompetitiver ELISA zum Nachweis von Lysozym in Käse entwickelt. Die Methode zeigte eine sehr gute Spezifität und Empfindlichkeit. Der verwendete anti-Lysozym-Antikörper zeigte weder unspezifische Wechselwirkungen mit der Käsematrix, noch Kreuzreaktionen zu Proteinen mit einer hohen Sequenzhomologie zu Lysozym, wie z. B. dem Molkenprotein α-Lactalbumin. Um die Zuverlässigkeit und Richtigkeit der ELISA Methode zu bestätigen, wurden lysozymhaltige Käseproben neben der Quantifizierung mit ELISA mit einer HPLC-FLD Methode als Referenzmethode gemessen. Sowohl für dotierte Käseproben als auch für lysozymhaltige Handelsproben wurde eine sehr gute Korrelation der Lysozymgehalte erzielt.
Des Weiteren wurde eine Nachweismethode entwickelt, deren Prinzip auf einer massenspektrometrischen Detektion des Lysozyms nach immunochemischer Aufreinigung beruht. Für die immunochemische Aufreinigung wurden magnetische Partikel verwendet, auf deren Oberfläche Protein G gebunden war. An diesen Partikeln wurden dann die anti-Lysozym IgG Antikörper immobilisiert. Mit Hilfe dieser Partikel konnte das Lysozym aus den Käseextrakten selektiv angereichert werden. Im Anschluss wurde das Lysozym hochspezifisch über seine Masse von 14313 Da mittels MALDI-TOF-MS nachgewiesen. Mit dieser Methode konnte zuverlässig zwischen lysozymhaltigen und lysozymfreien Käseproben unterschieden werden. Das Prinzip der Nachweismethode kann leicht auf andere Zielproteine in komplexen Lebensmittelmatrices übertragen werden und bietet daher ein breites Anwendungspotential, z. B. in der Allergenanalytik.
Weiterhin wurde eine HPLC Methode mit Fluoreszenzdetektion zur Quantifizierung von Lysozym in Käse optimiert und validiert. Die Methode zeigte sehr gute Präzision und Wiederfindungsraten. Die Nachweisgrenze dieser Methode lag bei 7,3 mg Lysozym/kg Käse. Mit dieser Methode wurden die Lysozymgehalte kommerziell erhältlicher Käseproben bestimmt. Lysozym war in 30 von 46 Käseproben nachweisbar. In sieben Fällen fehlte die Deklaration des Lysozyms auf der Lebensmittelverpackung. Die Lysozymgehalte lagen zwischen 30,8 und 386,2 mg Lysozym/kg Käse. Mit einem Lagerversuch von lysozymhaltigen Käse wurde die Stabilität von Lysozym während der Käsereifung untersucht. Es zeigte sich, dass Lysozym während der Reifung weitgehend stabil ist.
Für den Nachweis und die Quantifizierung des Konservierungsstoffs Nisin wurde eine LC-MS/MS Methode entwickelt. Eine bestehende ISO Standard Methode zur Quantifizierung von Nisin A mittels LC-MS/MS wurde optimiert und validiert. Für die Nisinvariante Nisin Z wurden eine SRM-Methode neu entwickelt und in die Methode zur Quantifizierung von Nisin A integriert. Weiterhin wurde die Stabilität des Nisins bei der Schmelzkäseherstellung untersucht. Dafür wurde nisinhaltiger Schmelzkäse selbst hergestellt. Durch die Erhitzung sanken die Wiederfindungsraten von Nisin signifikant. Um zu klären, zu welchen Produkten Nisin abgebaut wird, wurde eine Methode zum Nachweis der drei bekannten Hauptabbauprodukte von Nisin, unter anderem Nisin + H2O, entwickelt.
Es konnte kein signifikanter Anstieg von einem dieser Nisinabbauprodukte festgestellt werden. Bemerkenswert war jedoch der hohe Anteil von Nisin + H2O in den Nisinstandards. Ungefähr ein Drittel des gesamten Nisins lag als Nisin + H2O vor. Der Großteil dieser Modifikation war schon im Nisinstandard vorhanden. Ein Teil davon bildete sich aber auch während der Extraktion des Nisins aus dem Käse. Schließlich wurden mit einer Multimethode die Peptide Nisin A, Nisin A + H2O, Nisin Z und Nisin Z + H2O in kommerziell erhältlichen Schmelzkäseproben quantifiziert. In zwei Proben wurde Nisin Z nachgewiesen. Damit wurde gezeigt, dass die ISO Standard Methode zum Nachweis von Nisin A nicht ausreicht und der Nachweis von Nisin Z in die Standardmethode aufgenommen werden sollte.