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Fluoreszenzspektroskopische Untersuchungen zur Interaktion von antimikrobiellen und zellpenetrierenden Peptiden mit Biomembranen

Roll, Jan Tobias - Karlsruher Institut für Technologie (KIT) (2011)


Für membranaktive Peptide wie antimikrobielle und zellpenetrierende Peptide stellen Lipidmembranen keine unüberwindbaren Barrieren dar. Stattdessen interagieren sie mit diesen, was einerseits zur Translokation der Peptide ohne nachhaltige Membranschädigung, andererseits aber auch zur Zerstörung der Membran führen kann. Die Grenzen zwischen diesen beiden Extremen sind oft fließend und von noch nicht identifizierten Faktoren beeinflusst. Um das Verhalten der Peptide an Membranen realistisch einschätzen zu können, wäre die Kenntnis der bestimmenden Parameter von konkretem praktischem Nutzen, denn die Verwendung membranaktiver Peptide repräsentiert im therapeutischen Bereich ein innovatives Konzept zur Bekämpfung multiresistenter Bakterienstämme als auch im Bereich der Grundlagenforschung zum gezielten Transport membranimpermeabler Substanzen.

Zur Ermittlung von Faktoren, welche die Wirkung membranaktiver Peptide beeinflussen, werden Versuchssysteme benötigt, die einige wenige Parameter fokussieren und deren gezieltes Variieren ermöglichen. Hier bietet sich der Einsatz von Lipidvesikeln an, da diese ein fast ideales Modellsystem zur Untersuchung von Peptid-Lipid-Interaktionen darstellen. Ergänzend wäre eine Adaption der Untersuchungen von Peptidinteraktionen an lebenden Organismen wünschenswert, um die Auswirkungen an realen biologischen Systemen evaluieren zu können.

Zunächst sollte auf der Basis eines enzymatischen Reportersystems (CRE) an TLymphozyten eine erfolgreiche Translokation des zellpenetrierenden Peptids TAT demonstriert werden, denn dieses Peptid stellt ein etabliertes CPP dar, dessen Translokationseigenschaften nachfolgend sowohl an künstlichen wie an realen Membranen untersucht werden sollten.

Für die Translokationsexperimente sollte anschließend ein spezielles Konstrukt eingesetzt werden, welches aus demselben zellpenetrierenden Peptid TAT bestand, das nun an einen Fluorophor gekoppelt über eine Disulfidbrücke an einen Quencher gebunden war. Unter reduzierenden Bedingungen, wie sie üblicherweise in lebenden Zellen vorherrschen, sollte die erfolgte Translokation in das Cytoplasma über eine verstärkte Fluoreszenz nachgewiesen werden.

Um dieses TAT-Konstrukt zunächst biophysikalisch zu charakterisieren, sollte seine Translokation in Lipidvesikel hinein untersucht werden. Bei diesen Experimenten war sicher zu stellen, dass ein in Vesikel eingeschlossenes Reduktionsmittel quantitativ über die Versuchsdauer hinweg in den Vesikeln verbleibt, selbst im Falle einer ggf. durch das Peptid erfolgten Membranpermeabilisierung. Dazu musste ein geeignetes Reduktionsmittel an einen hochmolekularen polymeren Träger gekoppelt werden. Um generell destabilisierende Einflüsse von Peptiden auf die Membranintegrität vergleichend bewerten zu können, waren breit angelegte Untersuchungen auszuführen. Zum einen sollten hierdurch für den Translokationstest geeignete Peptide für die vorliegende wie auch für nachfolgende Arbeiten identifiziert werden. Im Hinblick auf stark membranschädigende Peptide sollten zum anderen - am Beispiel von zwei synergistisch verstärkend wirkenden antimikrobiellen Peptiden - fördernde und hemmende Einflussparameter auf die Porenbildung festgestellt werden.

Nach Synthese des TAT-Fluorophor-Quencher-Konstrukts - im Folgenden TAT-FQC genannt - war dessen Translokation in Lipidvesikel zu überprüfen, deren Zusammensetzungen u. a. die Membranen von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen simulieren, und mit der Translokation in reale Zellen zu vergleichen.


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