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Methodenentwicklung zur enantioselektiven Trennung von Polyphenolen in unterschiedlichen Matrices

Ritter, Christina - Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn (2011)


Im Rahmen dieser Arbeit wurden Methoden zur chiralen Trennung einiger enantiomerer als auch diastereomerer Polyphenole entwickelt und optimiert. Die Methodenentwicklung beschränkte sich hierbei nicht nur auf Inhaltsstoffe bestimmter Lebensmittel, sondern umfasste zusätzlich Humanplasma als komplexe biologische Matrix. Im Vordergrund der methodischen Entwicklungen stand die chirale Trennung der monomeren Flavan-3-ole (+)- und (-)-Catechin sowie (+)- und (-)-Epicatechin.

Die Wahl der eingesetzten analytischen Geräte war von der zu erwartenden Konzentrationsmenge der Verbindungen in der jeweiligen Matrix abhängig. In Kakao liegen hohe Konzentrationen an Catechinen vor. Orangen und Orangensäfte enthalten größere Mengen an Flavanonglykosiden. Folglich war es bei beiden Fällen erfolgversprechend, die Kapillarelektrophorese mit Diodenarraydetektor (DAD) als analytisches Verfahren einzusetzen.

Da der menschliche Organismus nur Bruchteile der aufgenommenen Flavanole resorbiert, sind im Humanplasma Konzentrationen im Nanogramm pro Milliliter-Bereich zu erwarten. Für einen derart niedrigen Konzentrationsbereich ist das CE-DAD System nicht ausreichend empfindlich. Als Verfahren der Wahl kam somit ein chirales HPLC-System mit coulometrischem Elektrodenarray-Detektor (CEAD) zum Einsatz, da diese Art von Detektion eine sehr hohe Empfindlichkeit aufweist.

Methodenentwicklung zur chiralen CE-Trennung von Flavanonglykosiden: Vier in Orangensaft vorkommende Flavanonglykoside (Hesperidin, Didymin, Narirutin und Narirutinglykosid) wurden unter Einsatz eines speziellen kapillarelektrophoretischen Verfahrens chiral, teilweise zum ersten Mal in ihre jeweiligen Diastereomere getrennt. Der erste Anhaltspunkt für die Methodenentwicklung war die Arbeit von Gel-Moret (2003), in welcher bereits die Flavanonglykoside Hesperidin und Narirutin mittels CE chiral analysiert wurden.

Zur Aufkonzentrierung der Verbindungen am Anfang der Kapillare und zur Verbesserung der Trennung wurde das "Sample Stacking"-Verfahren angewendet. Als chiraler Selektor wurde eine Kombination aus HP-β-CD und CM-β-CD eingesetzt. Durch Variation weiterer kapillarelektrophoretischer Parameter (pH-Wert des Puffers, Pufferzusammensetzung und CD-Konzentration) konnte eine Basislinientrennung aller vier Diastereomerenpaare erreicht werden.

Methodenentwicklung zur chiralen Trennung von Flavan-3-olen mittels CD-MEKC: Durch Einsatz eines kapillarelektrophoretischen Verfahrens, der CD-MEKC, wurde eine Referenzmethode zu der CZE-Methode von Kofink et al. (2007), entwickelt, die eine chirale Trennung der in Kakao vorkommenden monomeren Flavan-3-ole (Catechin und Epicatechin) ermöglicht. Hierzu wurden unterschiedliche Pufferzusammensetzungen und Pufferkonzentrationen getestet. Als Mizellbildner wurde SDS verwendet und dessen Konzentration optimiert. Der zur chiralen Trennung benötigte und am besten geeignete Selektor ist bei dieser Methode, wie auch bei der CZE, das HP-γ-CD.

Es wurden mit CD-MEKC sowie mit der CZE Kakaoproben analysiert und die erhaltenen Ergebnisse aus beiden Methoden verglichen, wobei sich eine sehr gute Übereinstimmung ergab.

Chirale Trennung der Flavan-3-ole in Humanplasma mittels HPLC-CEAD: Unter Verwendung einer permethylierten Gamma-Cyclodextrinsäule (PM-γ-CD) wurde eine chirale HPLC Methode zur Trennung der Catechin-Enantiomere entwickelt. Zusammen mit der Erprobung einer geeigneten Aufarbeitungsmethode für Humanplasmaproben ist es gelungen, die monomeren Flavan-3-ole der glucuronidierten und sulfatierten Metabolite chiral in Humanplasma nach Kakaogenuss zu analysieren.

Nach bisherigem Wissensstand ist dies die erste in der Literatur beschriebene chirale Trennung der Catechin-Enantiomeren in menschlichem Blutplasma. Die Methode liefert hohe Wiederfindungen und gute Reproduzierbarkeiten, sowie niedrige Werte für die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen. In einem Selbstversuch konnte schließlich gezeigt werden, dass tatsächlich beide Flavanol-Enantiomere vom menschlichen Organismus resorbiert werden. Anhand weiterer Selbstversuche wurde festgestellt, dass die atypischen Enantiomere offensichtlich einem anderen Metabolismus unterliegen oder möglicherweise nicht in dem gleichen Umfang resorbiert werden, wie die von Natur aus im Kakao vorkommenden Catechine.

Um dies exakt aufklären zu können, ist es erforderlich, die methylierten Catechine ebenfalls chiral analysieren zu können. Erst dann kann eine eindeutige Aussage über die Bioverfügbarkeit der Catechin-Enantiomere gemacht werden. Dies konnte im Laufe dieser Arbeit nicht realisiert werden.


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