Metabolomanalytik antiinfektiv wirkender Isochinolinalkaloide
Rikanovic, Carina - Julius-Maximilians-Universität Würzburg (2011)
Die zunehmende Entstehung von Resistenzen macht die Entwicklung neuer potenter Wirkstoffe zur Therapie von Infektionskrankheiten immer wichtiger. Dieser Aufgabe stellt sich auch der interdisziplinär aufgebaute SFB 630, in den sich die vorliegende Arbeit eingliedert. Innerhalb des SFBs wurden Isochinolinalkaloid-Derivate (IQs) synthetisiert, die aktiv gegen verschiedene Mikroorganismen sind.
Bioinformatische Modellierungen bilden die für den jeweiligen Mikroorganismus spezifischen Stoffwechselwege ab. In Netzwerkanalysen können Änderungen metabolischer Flüsse durch pharmakologisch aktive Substanzen vorhergesagt werden. Gemeinsam mit bioinformatischen Modellen liefern die Metabolommessungen Hinweise auf mögliche Wirkmechanismen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene analytische Methoden etabliert, um antiinfektive Wirkungen dieser verheißungsvollen Leitstrukturen auf das Metabolom verschiedener Mikroorganismen zu untersuchen. Die aus den Metabolommessungen erhaltenen Daten fließen in diese Modelle ein und tragen zu deren Optimierung bei.
Die Mikroorganismen wurden für die Metabolomanalysen mit aktiven IQs (für S. aureus und C. albicans GB-AP-143, für L. major GB-AP-304) inkubiert. Bei C. albicans erfolgte die Probennahme zu unterschiedlichen Zeitpunkten (lag-, log-, stationäre Phase), um auch die Zeitabhängigkeit der Effekte zu untersuchen. Zusätzlich dienten bei C. albicans als Kontrollen neben parallel angesetzten Zellkulturen ohne Inhibitor, auch Zellkulturen, denen das Lösungsmittel DMSO zugegeben wurde. Es wurden Extraktionsmethoden für die betreffenden Metabolite der hier untersuchten Mikroorganismen (S. aureus, C. albicans, L. major) etabliert. Dabei lag der Fokus auf polaren Metaboliten, da bioinformatische Modellierungen für die Effekte der IQs Änderungen vor allem im Purin- und Pyrimidinstoffwechsel der Mikroorganismen vorhersagten.
Zur Analyse des Nukleotidstoffwechsels wurde eine ionenpaarchromatographische HPLC-Methode entwickelt und optimiert. Mit dieser Methode konnten Nicotinamidderivate und Nukleotide des Purin- und Pyrimidinstoffwechsels in Zellextrakten von S. aureus, C. albicans und L. major quantifiziert werden. Für eine Analyse des Wirkmechanismus von GB-AP-143 wurde die Zusammensetzung des Metaboloms von C. albicans mittels einer GC/MS-Methode bestimmt. Nach einer Derivatisierung des Extrakts mit Methoxyamin-HCl und MSTFA konnten in einem Lauf zugleich Target- und Fingerprintanalytik durchgeführt werden. Die Auswertung der Targetanalytik fand unter Anwendung der NIST-Datenbank und Vermessung von Standards statt. Hierbei konnten vor allem Aminosäuren quantitativ erfasst werden. Der Fingerprint wurde durch Einsatz multivariater statistischer Verfahren ausgewertet.
Die Daten für die mit GB AP 143 behandelten S. aureus und die mit GB AP 304 behandelten L. major-Promastigoten liefern Hinweise auf eine Wirkung der IQs auf den Komplex-I der mitochondrialen Atmungskette. Für die Behandlung der C. albicans-Kulturen mit GB-AP-143 konnten komplexe Änderungen im Nukleotid- und Aminosäurestoffwechsel gemessen werden. So beeinflusste bereits der Zeitpunkt der Probennahme (lag-, log- oder stationäre Wachstumsphase) die Zusammensetzung des Metaboloms und auch das Lösungsmittel, das für die IQs verwendet wurde, verursachte komplexe Änderungen im Metabolom von C. albicans.
Zusätzlich wurden Nukleotid- und Aminosäurekonzentrationen Fluconazol-resistenter C. albicans-Mutanten (TAC, UPC und MRR) untersucht. Im Nukleotidstoffwechsel waren sowohl Konzentrationssteigerungen als auch ein Absinken der Konzentrationen im Vergleich zum Wildtyp zu verzeichnen. Der Aminosäurestoffwechsel zeigte insgesamt einen verminderten Gehalt an Aminosäuren der Mutanten gegenüber dem Wildtyp. Da GB-AP-143 auch Aktivität gegen diese Mutanten zeigte, wurde exemplarisch die MRR-Mutante mit GB-AP-143 inkubiert, um zu untersuchen, ob die durch GB-AP-143 hervorgerufenen Änderungen im Nukleotid- und Aminosäurestoffwechsel ähnlich zu denen des Wildtyps sind. Es konnten im Nukleotidstoffwechsel gegenläufige Effekte für die Inkubation von GB-AP-143 des Wildtyps und der Mutante verzeichnet werden.
Die Daten aus den HPLC/UV- und GC/MS-Messungen werden von der Bioinformatik zur Optimierung der verwendeten Modelle genutzt, um auf diese Weise die Wirkmechanismen der IQs besser modellieren zu können.
Da das Cytochrom-P-450-Enzymsystem am Metabolismus von etwa 95 % aller Arzneistoffe beteiligt ist, wurden die Effekte ausgewählter IQs auf die sechs wichtigsten arzneistoffmetabolisierenden Enzyme (CYP1A2, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6 und 3A4) mit Hilfe eines bereits etablierten CYP-Assays analysiert und näher charakterisiert. Im CYP-Assay zeigte sich für drei IQs eine CYP2D6-Hemmung. Die ausgeprägte CYP2D6-selektive Hemmung von GB-AP-110 ergab einen IC50-Wert von nur 109 nM. Die Charakterisierung der Hemmung ergab einen reversiblen, kompetitiven Inhibitionsmechanismus.