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Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zur Verstoffwechselung von Ammonium und Glutamin in Corynebacterium glutamicum

Rehm, Nadine - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (2010)


Corynebacterium glutamicum kann eine Vielzahl von Stickstoffquellen nutzen, darunter Ammonium und Glutamin. Die Assimilation dieser Stickstoffquellen wurde in dieser Arbeit durch die Charakterisierung verschiedener Deletionsmutanten untersucht. Mit Ammonium, der bevorzugten Stickstoffquelle von C. glutamicum, erhielt die Glutamatdehydrogenase (GDH) eine hohe Glutamatkonzentration aufrecht und garantierte ein schnelles Wachstum des Bakteriums. Durch Deletion des für die GDH kodierenden gdh-Gens wurde eine Stickstoffmangelantwort ausgelöst, wie es auch schon früher gezeigt wurde, und der Glutamatpool sank. Die Glutamatsynthase (GOGAT), die unter diesen Bedingungen synthetisiert wurde, übernahm in Abwesenheit der GDH zum Teil die Glutamatbildung. Waren weder GDH noch GOGAT vorhanden, so konnte auch ein Einfluss der Glutaminase auf den Glutamatpool beobachtet werden. Die Assimilation von Glutamin als Stickstoffquelle führte in allen Stämmen zu einer Stickstoffmangelantwort, was die Expression des für die GOGAT kodierenden gltBD-Operons auslöste. Die GOGAT war dabei gleichzeitig für ein schnelles Wachstum und die Aufrechterhaltung einer hohen Glutamatkonzentration verantwortlich. Die Deletion des gltBD-Operons führte zu einer starken Reduktion des Glutamatpools, und die Glutamatbildung wurde zum Teil durch die Glutaminase und wahrscheinlich auch durch die GDH übernommen. In Abwesenheit der GDH und der GOGAT war außerdem die Glutamin-abhängige Amidotransferase LtsA an der Glutamatsynthese mit Glutamin als Stickstoffquelle beteiligt. Insgesamt wurde festgestellt, dass C. glutamicum in der Lage ist, unabhängig von der eingesetzten Stickstoffquelle, in Abwesenheit entscheidend an der Glutamatbildung beteiligter Enzyme eine bestimmte Glutamatkonzentration durch verschiedene Regulationsmechanismen aufrechtzuerhalten. Dabei zeigte sich auch, dass ein hoher Glutamatpool für ein schnelles Wachstum von C. glutamicum sehr wichtig ist.

Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Glutamin von C. glutamicum auch als Kohlenstoffquelle genutzt werden kann, wobei es eine im Vergleich zu Glukose schlechte Kohlenstoff- und Energiequelle darstellt. An der Verstoffwechselung ist die Glutaminase entscheidend beteiligt, wie durch Wachstumsanalysen und Messung der intrazellulären Glutamat- und Glutaminkonzentrationen gezeigt wurde.

Bisher wurde der Indikator des Stickstoffstatus in C. glutamicum nicht eindeutig identifiziert. In dieser Arbeit wurde festgestellt, dass eine durch das Wachstum mit Glutamin, Glutamat oder Kreatinin als Stickstoffquelle ausgelöste Stickstoffmangelantwort durch einen Ammoniumpuls innerhalb weniger Minuten unterdrückt wird. Dadurch konnte die Vermutung, dass u.a. Ammonium den Stickstoffstatus der Zelle signalisiert, weiter bekräftigt werden. Da die Kultivierung mit Harnstoff zu einer Repression Stickstoff-regulierter Gene führte, wird vermutlich die intrazelluläre Ammoniumkonzentration wahrgenommen. Glutamat und Glutamin konnten als mögliche Indikatoren ausgeschlossen werden.

In einem letzten Teil der Arbeit wurde die Stellung der Glutaminsynthetase (GS) und die der GS-Aktivität regulierenden Adenylyltransferase GlnE in der Stickstoffkontrolle untersucht. Zu Beginn der Arbeit gab es Hinweise, dass Deletionen der Gene glnA und glnE, die für die GS bzw. GlnE kodieren, schon unter guter Stickstoffversorgung zu einer Stickstoffmangelantwort führen, was in dieser Arbeit bestätigt wurde. Proteininteraktionsexperimente anhand von Pulldown-Analysen mit gereinigter GS und C. glutamicum-Zellextrakt bzw. mit gereinigtem GlnE und C. glutamicum-Zellextrakt konnten eine Interaktion von GS und GlnE bestätigen. Eine mögliche Interaktion des PII-Signaltransduktionsproteins GlnK mit der GS oder mit GlnE konnte nicht nachgewiesen werden.


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