Charakterisierung und Stabilisierung der löslichen Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16 für den technischen Einsatz bei der reduktiven Cofaktorregenerierung
Ratzka, Juliane - Technische Universität Berlin (2011)
Die lösliche Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16 (SH) ist aufgrund ihrer Bidirektionalität und ihrer Toleranz gegenüber Sauerstoff ein vielversprechender Biokatalysator zur Regenerierung des Cofaktors NADH. In diesem Zusammenhang wurde das Potential dieses Enzyms für eine entsprechende Anwendung ermittelt und bewertet. Dazu wurde zunächst der Einfluss verschiedener technisch relevanter Parameter, u.a. die Temperatur, der pH und unkonventioenelle Cosolventien, auf die Aktivität und Stabilität der SH systematisch untersucht.
Im Rahmen dieser Studien zeigte das Enzym eine ausgeprägte Sensitivität, insbesondere gegenüber verschiedenen Konzentrationen von Cosolventien wie organische Lösungsmittel und ionische Flüssigkeiten, die aufgrund ihrer löslichkeitsvermittelnden Eigenschaften in einer Vielzahl technischer Anwendungen benötigt werden. Auf Basis dieser Resultate wurde die SH mittels der chemischen Modifizierung mit Methoxypolyethylenglykol sowie der adsorptiven und kovalenten Immobilisierung auf Amberlite FPA54 stabilisiert. Dabei konnten Stabilisierungsfaktoren von bis zu 6 in rein wässrigen Lösungen bei optimalen Aktivitätsbedingungen und unter mechanischer Beanspruchung erzielt werden.
In Gegenwart der untersuchten organischen Lösungsmittel ließ sich die Stabilität der SH um Faktoren von bis zu 159 erhöhen. Zudem führte die Immobilisierung des Enzyms zu Stabilisierungsfaktoren von bis zu 17 in den gewählten ionischen Flüssigkeiten. Schließlich wurde die SH in ihrer nativen sowie in ihren stabilisierten Formen als NADH-Regenerierungskatalysator in Kopplung mit der Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis (CPCR) eingesetzt.
Die dabei gemessenen Reaktionsumsätze und die berechneten total turnover numbers (TTN: nProdukt/nEnzym) wurden direkt mit denen der üblich verwendeten Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii (FDH) verglichen. Dabei konnte die SH annähernd vollständige Reaktionsumsätze erzielen und eine TTN von bis zu 143666. Diese TTN war beachtlich höher als die der FDH. Des Weiteren wurde die immobilisierte SH rezykliert und bei einer zweiten Cofactorregenerierung eingesetzt. Dabei konnten bei der Durchführung der zweiten Reaktion ähnlich hohe Reaktionsumsätze wie bei der ersten Reaktion erzielt werden.