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Entwicklung flüssigkeitschromatographisch-massenspektrometrischer Methoden zum Nachweis von Mykotoxinen im Hausstaub

Portner, Christoph - Carl von Ossietzky Universität Oldenburg (2012)


Etwa 10 % der Haushalte in Deutschland haben einen direkt sichtbaren Schimmelpilzbefall im Wohnraum. Schimmelpilze können toxische Substanzen (Mykotoxine) produzieren. Diese schwerflüchtigen Verbindungen können sich zusammen mit Partikeln und Sporen im Hausstaub anreichern. Mehr als 400 Schimmelpilzgifte (Mykotoxine) sind heute bekannt, aber nur wenige sind als Referenzsubstanzen käuflich zu erwerben. Bisher wurden Mykotoxine im Innenraum nur an artifiziellen oder fallinduzierten Proben untersucht. Über das Vorkommen von Mykotoxinen in Haushalten ohne sichtbaren Schimmelpilzbefall ist bisher nur wenig bekannt.

Vor diesem Hintergrund war das Ziel meiner Arbeit die Entwicklung von sensitiven und selektiven Nachweisverfahren zur Quantifizierung und Identifizierung von ausgewählten Mykotoxinen in Materialien des Innenraums wie Hausstaub auf Basis flüssigkeitschromatographischer Trennung und massenspektrometrischer Detektion. Die Methoden sollten zur Ermittlung von Hintergrundwerten an einer statistisch relevanten Anzahl von Proben angewandt werden.

In dieser Studie wurden 500 Hausstaubproben aus dem bevölkerungsrepräsentativen Kollektiv der Kontrollgruppe der Norddeutschen Leukämie- und Lymphomstudie (NLL) untersucht. Zusätzlich wurden 354 Hausstaubproben zusammen mit einem Fragebogen aus verschiedenen Regionen Deutschlands selbst gesammelt. Diese ließen sich in 153 Proben mit (Schadensfallproben) und 201 ohne (Kontrollproben) sichtbaren Schimmelpilzbefall im Wohnraum unterteilen.

Für die Untersuchungen wurde Hausstaub unbekannten Alters eingesetzt, auf ≤ 63 μm Partikelgröße gesiebt und extrahiert. Die zur Analyse vorgesehenen Mykotoxine wurden anhand einer Literaturrecherche über ihr Vorkommen in Innenräumen, der toxikologischen Relevanz und der Verfügbarkeit von Referenzstandards ausgewählt. Aflatoxin B1, Citrinin, Deoxynivalenol, Diacetoxyscirpenol, Gliotoxin, Ochratoxin A, Roridin A und Sterigmatocystin wurden ausgewählt, um mittels Flüssigkeitschromatographietandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) in den extrahierten Hausstaubproben quantifiziert zu werden. Die entwickelte Methode ist empfindlich, selektiv und zuverlässig für die ausgewählten Zielverbindungen. Die Nachweisgrenzen betrugen zwischen 1,1 und 6 μg/kg Hausstaub ≤ 63 μm. Die Wiederfindungsraten lagen zwischen 40 % für Deoxynivalenol und 89 % für Sterigmatocystin. In 31 von 854 analysierten Hausstaubproben konnten die Mykotoxine Citrinin, Deoxynivalenol, Ochratoxin A und Sterigmatocystin quantifiziert werden. Die Konzentrationen lagen im unteren μg pro kg Hausstaub Bereich. Die maximale Konzentration für das am häufigsten detektierte Mykotoxin Sterigmatocystin betrug 2.070 μg/kg Hausstaub. Es gab keinen eindeutigen Zusammenhang zwischen einem Schimmelpilzbefall im Wohnraum und den nachgewiesenen Mykotoxinen.

Aufgrund der Tatsache, dass Satratoxin G und H als Referenzsubstanzen nicht zur Verfügung stehen, wurden verschiedene Stämme von Stachybotrys chartarum kultiviert und extrahiert. Die Extrakte wurden für die qualitative Untersuchung der produzierten Mykotoxine mit unterschiedlichen Messmethoden durch Kopplung von Flüssigkeitschromatographie und einem Hybridmassenspektrometer, einem Flugzeitmassenspektrometer und einem Quadrupolflugzeitmassenspektrometer analysiert.

Die Mykotoxine Satratoxin G, H und ihre Isomere des Schimmelpilzes Stachybotrys chartarum konnten auch ohne Bezug auf Referenzsubstanzen mit den verschiedenen LC-MS-Messverfahren eindeutig nachgewiesen werden. Mit dem Hybridmassenspektrometer konnten die Mykotoxine anhand ihrer Vorläuferionen und dem spezifischen Fragmentierungsmuster charakterisiert werden. Die Summenformeln der Analyten wurden durch Kapillar-Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit einem Flugzeitmassenspektrometer (Cap-HPLC-TOF-MS) bestätigt. Mit einer sehr guten Massengenauigkeit konnten die Vorläuferionen und das Fragmentierungsmuster durch Messungen mit einem Quadrupolflugzeitmassenspektrometer (HPLC-QTOFMS) bestätigt werden.

Die Messmethoden mit informationsabhängigen MSExperimenten maximierten die Informationen in einem Chromatographielauf. Die Kombination von Charakterisierung der chemischen Struktur anhand des Fragmentierungsmusters und hochauflösender MS bot die Möglichkeit einer Überprüfung der ausgewählten Verbindungen in einem spurenanalytischen Bereich von ppm bis ppb in einer komplexen Matrix.

Die entwickelten Messmethoden konnten zur Untersuchungen der Toxinprofile bei der Biosynthese von Mykotoxinen an unterschiedlichen Stämmen von Stachybotrys chartarum verwendet werden. Anhand des Toxinprofils war es möglich auch ohne molekularbiologische Methoden zwei morphologisch identische Chemotypen von Stachybotrys chartarum zu unterscheiden. Nur der Chemotyp S ist in der Lage die hoch zytotoxischen Mykotoxine aus der Gruppe der makrocyclischen Trichothecene zu produzieren. Chemotyp A produziert die weniger giftigen Atranone. Fünf Wildstammisolate des Chemotyps S wurden unter verschiedenen Bedingungen inkubiert, um die Bildung von Satratoxin G und H zu analysieren. Der maximale Gehalt von Satratoxin G wurde mit 297 ng/g Myzel und für Satratoxin H mit 164 ng/g Myzel bei Stamm S1624 inokuliert bei Raumtemperatur auf Instantreisflocken bestimmt.

Im Vergleich zur Literatur sind die maximalen Gehalte der analysierten Trichothecene in den untersuchten Proben sehr niedrig. Mögliche Gründe dafür sind die semi-quantitative Bestimmung durch Kalibration mit dem strukturverwandten Roridin A oder die untersuchten Stämme und Inkubationsbedingungen. Mit den entwickelten flüssigkeitschromatographischen Trennverfahren und massenspektrometrischen Detektionsmethoden konnten Mykotoxine sensitiv und selektiv in Materialien des Innenraums nachgewiesen werden. Mit den Analysemethoden war auch ohne Referenzsubstanzen im spurenanalytischen Konzentrationsbereich eine Charakterisierung und Identifizierung von Mykotoxinen möglich.

Die Untersuchung der Hausstaubproben auf ausgewählte Mykotoxine zeigt trotz weniger positiver Befunde, dass diese in gesundheitlich relevanten Konzentrationen vorhanden sind.


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