Spektrale Modulationen in der Femtosekunden-Stimulierten Raman-Mikroskopie
Plötz, Evelyn Christine - Ludwig-Maximilians-Universität München (2011)
Femtosekunden-stimulierte Raman-Mikroskopie (FSRM) stellt eine neuartige Technik im Bereich der Schwingungsmikroskopie dar, die die optische Bildgebung mit der chemischen Sensitivität der Raman-Streuung kombiniert. Sie ermöglicht eine quantitative, ortsaufgelöste Darstellung mikroskopischer Präparate. In der FSRM beruht der chemische Kontrast auf der Femtosekunden-stimulierten Raman-Streuung (FSRS), einem nichtlinearen Raman-Prozess, dessen Signal gegenüber der spontanen Raman-Streuung um mehrere Größenordnungen verstärkt ist. Die FSRM profitiert daher von verkürzten Messzeiten sowie einem verbesserten Signal/Rausch-Verhältnis. Obwohl es sich bei der FSRS um einen optisch nichtlinearen Effekt handelt, gleicht ihre spektrale Signatur der (polarisierter) spontaner Raman-Spektren. Signalbeiträge einer möglichen Autofluoreszenz der Probe tragen nicht bei.
FSRM erweist sich als besonders geeignet für die chemische Bildgebung von biologischen Systemen, wie Zellen und Gewebe. Deren Signalstärken sind äußerst niedrig und erfordern daher Daten mit hohen Signal/Rausch-Verhältnissen für eine spezifische Analyse.
All diese Anforderungen kann FSRM erfüllen. Die lineare Abhängigkeit des FSRS-Signals von der Konzentration der Probe erleichtert zudem die quantitative Analyse der molekularen Probenzusammensetzung. Die Zusammensetzung zellulären Gewebes auf molekularer Ebene ist sehr heterogen. Eine spektral breitbandige Information - wie sie die FSRM liefert - ist daher zur chemisch-spezifischen Bildgebung unabdingbar.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, FSRM in der biologischen und medizinischen Bildgebung zu implementieren. FSRM ist eine rasternde Mikroskopie-Technik, die auf der nichtlinearen Wechselwirkung zweier ultrakurzer Laserimpulse mit einem Raman-aktiven Medium beruht. Es kommen ein spektral schmaler und intensiver Pikosekundenimpuls (Raman-Pumpimpuls) sowie ein spektral breitbandiger und schwacher Femtosekunden-Impuls (Raman-Abtastimpuls) zum Einsatz. Beide Laserimpulse werden kollinear in ein rasterndes Mikroskop eingekoppelt, an dessen Fokus stimulierte Raman-Streuung in der Probe auftritt. Diese Wechselwirkung führt zu einer spektralen Modifikation des Raman-Abtastimpulses, dessen Spektrum in An- und Abwesenheit des Raman-Pumpimpulses mit Hilfe eines Vielkanaldetektors aufgezeichnet wird. Das FSRS-Spektrum ergibt sich aus dem Verhältnis der beiden detektierten Spektren. Durch Abrastern der Probe wird das ortsaufgelöste FSRS-Spektrum bestimmt. Als bisherige Laserquelle diente ein Laser-/Verstärkersystem, dessen Lichtleistung nicht kompatibel zu den Anforderungen biologischer Systemen ist.
Der erste Teil der Arbeit beschreibt die neuentwickelte Lichtquelle für FSRM, welche auf einem hoch-repetierenden Laser-Oszillator beruht. Dessen ultrakurze Laserimpulse weisen eine spektrale Bandbreite von über 3000 cm1 auf und dienen direkt als Raman-Abtastimpulse. Der Raman-Pumpimpuls wird mithilfe eines Ytterbium-basierten Faserverstärkers aus dem Spektrum des Lasers generiert. Stimulierte Raman-Mikroskopie gilt als eine störungsfreie, nichtlineare Mikroskopie-Technik. Im Rahmen dieser Arbeit wird erstmals über einen zusätzlichen nichtlinearen Beitrag in der FSRM berichtet, der sich als eine starke Oszillation der Grundlinie im Spektrum bemerkbar macht. Er führt zu einer Verschlechterung des Signal/Rausch-Verhältnisses sowie zur Verringerung der spektralen Selektivität. Als Ursache kann eine spektrale Interferenz zwischen dem elektrischen Feld des Raman-Abtastimpulses und einem zusätzlichen, in einem Vier-Wellen-Mischprozess zwischen Raman-Pump- und Raman-Abtastimpuls erzeugten Feld identifiziert werden. Eigenschaften und Methoden zur Unterdrückung der spektralen Interferenz werden vorgestellt.