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Globale Metabolomanalyse von Corynebacterium glutamicum : Chancen und Herausforderungen der Gaschromatographie-Massenspektrometrie für das Metabolic Fingerprinting

Pflug, Simon - Universität Stuttgart (2010)


Metaboliten sind niedermolekulare (<1000 Da), organische Verbindungen, die an Stoffwechselreaktionen beteiligt sind. Analog zum Genom oder Proteom bezeichnet man die Gesamtheit aller Metaboliten eines biologischen Systems als Metabolom. Für die wissensbasierte Optimierung industrieller Produktionsstämme ist die Metabolomanalyse eine wichtige Grundlage. Ein aus biotechnologischer Sicht besonders interessanter Organismus ist Corynebacterium glutamicum. Die Produktion von Aminosäuren mit genetisch modifizierten Corynebacterium-Stämmen gehört, bezogen auf die jährlich produzierte Menge, zu den wichtigsten biotechnologischen Prozessen. Aminosäuren werden als Futtermittelzusatz, Geschmacksverstärker und Massenprodukt für pharmazeutische Anwendungen benötigt. Deshalb wird ein tieferes Verständnis des Stoffwechsels und seiner Regulation angestrebt.

Für die Metabolomanalyse kommen zahlreiche analytische Methoden zum Einsatz. Von diesen wird die Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) allgemein als der Goldstandard bezeichnet. Aufgrund der Trennleistung eignet sich diese Methode zur Trennung komplexer Gemische, wie Zellextrakten. Auf der Seite des Massenanalysators werden meistens Flugzeitmassenspektrometer (Time-Of-Flight, TOF) verwendet. Sie kombinieren eine hohe Scanrate mit einer akkuraten Massenbestimmung über einen weiten Massenbereich (bis mehr als m/z 1000). In dieser Arbeit wurde eine semi-quantitativen GC-MS Analytik etabliert und das Metabolommuster in Zellextrakten von C. glutamicum im ungerichteten Ansatz (metabolic fingerprinting) abgebildet. Auf Seiten des Massenanalysators wurde dafür die Elektronenstoß-Ionisation eingesetzt, um reproduzierbar Fragmentspektren zu erzeugen und zu identifizieren. Im Zuge der Untersuchungen wurden 90 Metaboliten nach Extraktion der polaren und 22 Metaboliten nach Extraktion der lipophilen Metaboliten zweifelsfrei in den Zellextrakten von C. glutamicum identifiziert. Daneben wurde der in der Literatur beschriebene, hohe Anteil nicht identifizierbarer Peaks in den GC-MS Profilen (~50%) bestätigt. Mit Hilfe der vergleichenden Metabolomanalyse konnten signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Stämmen und über den Wachstumsverlauf des Lysinproduzenten DM1933 aufgezeigt werden. Diese fielen geringer aus als erwartet und beschränkten sich zumeist auf Metaboliten des Zentralstoffwechsels und auf Zwischenprodukte, wie Aminosäuren, die unmittelbar oder mittelbar daraus hervorgehen.

In einem zweiten Teil der Arbeit wurde die Chemische Ionisation zur Bestimmung der exakten Molekülionenmasse etabliert. Die Identifikation einer mittels GC-MS bestimmten Masse eines unbekannten Analyten geschieht über den Umweg großer Listen aller möglichen, für diese Masse berechneten Summenformeln. Hierfür wurde mit dem Juelich Mass Analyzer (JUMA) eine Softwarelösung entwickelt, die leistungsfähige Filter mit einer virtuellen Entderivatisierung, einer automatischen Klassifizierung der Summenformeln auf der Basis bekannter Analyten und einem multiplen Datenbankabgleich verbindet. Nach erfolgreicher Validierung auf den Massen bekannter Analyten wurde diese Lösung in Kombination mit stabiler Isotopenmarkierung eingesetzt, um die Herkunft der hohen Anzahl nicht identifizierter Massen im Chromatogramm aufzuklären. Insgesamt konnten so 56 zuvor unbekannte Massen als biologisch relevant und 64 weitere eindeutig als Kontaminationen ohne biologische Relevanz identifiziert werden. Mit diesen Arbeiten ist auch die Voraussetzung für den Zugang zu bisher messtechnisch nicht erfassten Analyten bereitet worden.


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