Mikrobielle und enzymatische Hydrolyse von cyclischen Dipeptiden (Diketopiperazine) sowie Etablierung von Analysemethoden zum Nachweis der Edukte und Produkte

Perzborn, Mareike - Karlsruher Institut für Technologie (KIT) (2012)

Diketopiperazine (DKPs) sind cyclische Dipeptide und stellen eine in der Natur weit verbreitete Klasse biologisch aktiver Substanzen dar. Einige DKPs weisen antibakterielle, antifungale oder antivirale Aktivitäten, sowie Phytotoxizität oder Zytotoxizität auf.

In dieser Arbeit wurde die enzymatische und mikrobielle Spaltung dieser Moleküle untersucht. Dabei wurden elf DKPs verwendet, von denen acht aus proteinogenen Aminosäuren und drei aus nicht proteinogenen Aminosäuren aufgebaut sind. Für die Quantifizierung der Edukte (DKPs) und potentieller Produkte (lineare Dipeptide) wurde eine HPLC-Analytik zur Detektion und Trennung der underivatisierten Substanzen etabliert und erfolgreich entsprechend den bioanalytical method validation Richtlinien der U.S. Food and Drug Administration validiert. Die entwickelten Methoden erwiesen sich als geeigneter als der Nachweis der Substanzen mittels Vorsäulenderivatisierung (z. B.: Dabsyl-Cl und FMOC-Cl). Für das racemische DKP Cyclo(DL-Ala-DL-Ala) und das entsprechende Dipeptid DL-Ala-DL-Ala konnte darüber hinaus eine Methode zur Trennung der jeweiligen Diastereomere entwickelt werden. Mit den etablierten Methoden konnten überwiegend sehr gute Trennungen (Auflösungen R > 1,5) und kurze Analysezeiten (Retentionszeiten t_R < 15 min) erzielt werden. Für alle untersuchten DKPs, Dipeptide und Aminosäuren wurden lineare Bereiche mit Bestimmtheitsmaßen R² von mindestens 0,998 und mit Nachweisgrenzen zwischen 0,005 und 0,1 mM bestimmt. Die Bestimmungsgrenze variierte abhängig von der Substanz zwischen 0,05 und 10 nmol pro 10 μl Injektionsvolumen.

Die etablierten HPLC-Methoden wurden zur Identifizierung von Biokatalysatoren für den Abbau von DKPs eingesetzt. Dies führte zu folgenden Ergebnissen:

Die in der Literatur beschriebene peptidasekatalysierte Hydrolyse einiger DKPs wurde widerlegt. Auch mit weiteren eingesetzten Peptidasen und DKPs wurde kein Abbau nachgewiesen. Diese Ergebnisse deuten auf eine außerordentliche Peptidasestabilität der Peptidbindungen in den untersuchten Molekülen hin.
Viele Schwämme und Schwamm-assoziierte Bakterien sind für die Synthese von DKPs beschrieben. Um neue DKP-abbauende Bakterien zu identifizieren, wurde ein Screening mit Schwammproben und Cyclo(Gly-Gly) und Cyclo(DL-Ala-DL-Ala) als einziger Stickstoffquelle durchgeführt. Dabei konnten 114 marine Stämme isoliert werden. Davon wurden 49 bezüglich ihrer Fähigkeit diese DKPs abzubauen untersucht, jedoch zeigte keiner der Stämme eindeutige Aktivität.
Für die Stämme Paenibacillus chibensis (DSM 329) und Streptomyces flavovirens (DSM 40062) konnte die in der Literatur beschriebene Aktivität gegenüber Cyclo(L-Asp-L-Phe) bestätigt werden. Zudem wurde für DSM 329 erstmals die hydrolytische Spaltung von Cyclo(L-Asp-L-Asp) nachgewiesen. Die weiteren in dieser Arbeit verwendeten DKPs wurden von beiden Stämmen nicht hydrolysiert. Die Hydrolyse von Cyclo(L-Asp-L-Phe) durch DSM 329 wurde stark durch den Metallopeptidaseinhibitor EDTA und schwach durch den Serinpepidaseinhibitor PMSF und den Cysteinpeptidaseinhibitor E-64 inhibiert. DSM 40062 zeigte einen gesteigerten Abbau von Cyclo(L-Asp-L-Phe) nach vorheriger Induktion mit dieser Substanz während der Kultivierung. Für beide Stämme konnte eine Anreicherung der DKP-hydrolysierenden Enzyme mittels fraktionierter Ammoniumsulfatfällung und Ionenaustausch-chromatographie erzielt werden.
Stämme mit beschriebener cyclische Amidase Aktivität, welche Hydantoine und Dihydropyrimidine umsetzen, wurden bezüglich der hydrolytischen Spaltung strukturell ähnlicher DKPs untersucht. Für alle 34 eingesetzten Stämme wurde der Abbau des als Positivkontrolle eingesetzten Dihydropyrimidins Dihydrouracil gezeigt. Darüber hinaus konnte für drei dieser Stämme erstmals der eindeutige Abbau von DKPs nachgewiesen werden. Für Leifsonia sp. K3 und Bacillus sp. A16 wurde die Hydrolyse von Cyclo(DL-Ala-DL-Ala) und Cyclo(Gly-L-Phe), für Rhizobium sp. NA04-01 die Spaltung von Cyclo(L-Asp-L-Phe), Cyclo(Gly-L-Phe) und Cyclo(L-Asp-L-Asp) detektiert.
Es wurden zwei neue Isolate für den enantioselektiven Abbau von Cyclo(DL-Ala-DL-Ala) identifiziert, die mittels 16S rDNA Sequenzierung und Sequenzalignment als Paenibacillus sp. und Microbacterium sp. klassifiziert werden konnten. Das racemische Substrat Cyclo(DL-Ala-DL-Ala) wurde nur zu 75 % abgebaut. Durch Einsatz des Enantiomers Cyclo(L-Ala-L-Ala) und der zur Trennung der Diastereomere von Cyclo(DL-Ala-DL-Ala) etablierten Analytik konnte die vollständige Hydrolyse von Cyclo(L-Ala-L-Ala) und Cyclo(L-Ala-D-Ala) nachgewiesen werden, wohingegen das Enantiomer Cyclo(D-Ala-D-Ala) nicht angegriffen wurde. Mit diesen beiden Eigenisolaten konnte zum ersten Mal die enantioselektive Hydrolyse eines racemischen DKPs nachgewiesen werden.

Insgesamt wurden fünf Bakterienstämme neu für die DKP-Hydrolyse identifiziert. Davon wurden zwei Stämme im Rahmen dieser Arbeit isoliert. Bei Untersuchungen mit diesen beiden Eigenisolaten konnte erstmalig die enantioselektive Hydrolyse eines racemischen DKPs nachgewiesen werden. Zum ersten Mal konnte der mikrobielle Abbau der DKPs Cyclo(Ala-Ala) und Cyclo(Asp-Asp) gezeigt werden.

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