Unsere Seite auf

Dissertationen
Linksammlung durchsuchen

 

H+-ATPsynthasen: Immobilisierung an Grenzächen und Einbau in Lipidmembranen und deren Untersuchung mittels Einzelmolekül-Fluoreszenz-Spektroskopie

Oswald, Peter - Albert-Ludwigs-Universität Freiburg (2011)


H+-ATPsynthasen sind membranintegrierte Enzyme, die die Synthese von ATP aus ADP und anorganischem Phosphat mit einem transmembranen Protonentransport koppeln. Bei dieser Reaktion treibt der Protonentransport die Rotation der Rotoruntereinheiten (γεc10) relativ zu den Statoruntereinheiten (α3β3δab2) an und diese Bewegung ruft Konformationsänderungen in den Nukleotidbindungsstellen hervor, die zur Synthese von ATP führen. Der Mechanismus dieser Reaktion kann in einem konfokalen Mikroskop an einzelnen Enzymmolekülen mit Hilfe des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (spFRET) untersucht werden. Hierzu wird die H+-ATPsynthase an einer Rotoruntereinheit (ε) und einer Statoruntereinheit (b) mit einem Donor- und einem Akzeptor Fluorophor markiert und danach in die Membran eines Liposoms integriert. Bei diesen Untersuchungen tritt das Problem auf, dass die Beobachtungszeit durch die Diffusion der Liposomen durch das konfokale Volumen auf etwa 50 ms begrenzt ist. In dieser Arbeit wurden untersucht, ob und wie es möglich ist, eine signifikante Verlängerung der Beobachtungszeit zu erreichen.

Zuerst wurde versucht, Liposomen mit einer eingebauten H+-ATPsynthase an einer Glasoberfäche zu immobilisieren. Die optimalen Ergebnisse (in Bezug auf Stabilität, Anzahl der immobilisierten Liposomen und Untergrundsignal) wurden durch Modifizierung der Glasoberfläche mit Biotin, gebunden an Seruminalbumin, erreicht. Zugabe von Steptavidin erlaubt dann die Bindung von Liposomen, sofern diese Biotinlipide enthalten. Der Erfolg der Bindung wurde untersucht mit Biotinliposomen, die zusätzlich etwa 20 Tetramethylrhodaminlipidmoleküle (TMR-Lipid) pro Liposom enthielten. Die Oberfläche wurde durch konfokales Rastern abgebildet und es wurden etwa 4 immobilisierte Liposomen pro 100 µm2 detektiert. Es wurde ein Liposom selektiert und dessen Fluoreszenz beobachtet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Fluoreszenz schrittweise abnimmt, wobei ein Schritt dem Ausbleichen eines TMR-Moleküls entspricht. Die mittlere Lebensdauer eines TMR-Moleküls im Anregungsfokus des konfokalen Volumens war 450 ms. Die gemessene Fluoreszenzintensität eines Moleküls stimmte mit der aus apparativen Daten und Moleküldaten abgeschätzten gut überein, so dass die Methode geeignet ist, einzelne Moleküle auf der Oberfläche zu detektieren. Um das markierte Enzym beobachten zu können, wurden die bleichanfälligen organischen Fluorophore durch Nanokristalle (Quantenpunkte, QDs) ersetzt. QD585 konnte über einen Crosslinker an das Enzym gebunden werden, allerdings ging dabei die Syntheseaktivität verloren. Diese markierten H+-ATPsynthasen enthielten QD585 gebunden an b64C als Donor und ATTO 647N gebunden an ε56C als Akzeptor. Mit diesem System konnten erste Einzelmolekülmessungen an der Oberfläche durchgeführt werden. Als Beobachtungszeit wurde 60 s gewählt. Die gemessenen FRET-Effizienzen konnten in drei Zustände unterteilt werden. Die Daten wurden mit Gauss-Verteilungen angepasst und aus den mittleren FRET-Effizienzen wurden drei Abstände erhalten. Diese Abstände stimmten mit den Cα-Abständen zwischen b64C und ε56C des Homologiemodell von EF0F1 überein. Die Befunde zeigen, dass Einzelmoleküluntersuchungen mit an der Glasoberfläche immobilisierten H+-ATPsynthasen möglich sind, und dass deutlich längere Beobachtungszeiten erreicht wurden.

In einem weiteren Ansatz wurde versucht, das Enzym in eine Lipiddoppelmembran einzubauen. Hierdurch wäre es möglich, eine elektrischen Potentialdifferenz an der Membran anzulegen, und durch deren Variation die H+-ATPsynthase in ATP-Hydrolyse- und ATP-Syntheserichtung zu betreiben. Es wurde mit Hilfe der "Painted planar lipid bilayer"-Methode eine Lipiddoppelschicht in einem Loch (80 µm Durchmesser) in einer Teflonmembran erzeugt. H+-ATPsynthasen, die mit QD585 markiert war, wurden in Nystatin/Ergosterol-Liposomen rekonstituiert. Die Fusion dieser Liposomen konnte elektrisch verfolgt werden, da dabei in die Lipiddoppelschicht Nystatin/Ergosterol-Ionenkanäle eingebaut wurden. Die dabei auftretende Zunahme der elektrischen Leitfähigkeit der Membran wurde gemessen. Die Diffusion des Enzyms in der Lipidbilayer wurde optisch in einem Mikroskop mit TIRF-Anregung gemessen. Der gemessene Diffusionskoeffizient war 1,6 µm2/s in Übereinstimmung mit dem berechneten Wert.


—> Volltext

Abonnieren:

Empfehlen: