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Herstellung von DNA induzierten mono-/ polyklonalen Antikörpern, zur Schnelldetektion von hochpathogenen viralen Erregern und bioterroristisch relevanten Toxinen

Niederstadt, Lars - Freie Universität Berlin (2012)


Bioterroristisch verwendbare Agenzien haben gemeinsam, dass sie schwere gesundheitliche Auswirkungen im Falle der Infektion oder Intoxikation verursachen. Dieser Umstand hat dazu geführt, dass trotz der unmittelbaren Bedrohung durch den Bioterrorismus bis zum heutigen Tage nur wenige zuverlässige diagnostische Mittel zur Detektion von nativen Bioterrorstoffen verfügbar sind.

Im Zuge der Arbeit wurden durch die rekombinante DNA-Technologie synthetische Vektoren geschaffen, die eine Expression von nativen Proteinkonformationen für zwei Kandidatenagenzien, BoNT und die Glykoproteine (GP) der Filoviren MarV und EboV, ermöglichten. Die synthetischen Nukleinsäuresequenzen wurden hierbei für den Einsatz in Säugern kodonoptimiert und für eine optimale Verwendung durch Mutation der Ursprungssequenz modifiziert. Für BoNT A1 wurden zwei Modifikationen der Aminosäureabfolge vorgenommen, um durch die Inhibition der Zink-Bindung eine vollständige Entgiftung des Enzyms zu erreichen. Die filoviralen GP-Konstrukte wurden durch Entfernung einer slipperysite (EboV) auf die Expression des Volllängenglykoproteins Gp0 optimiert. Nach dem Aufbau und der Evaluierung von nativen Selektionssystemen, durch einen capture Assay, unter Verwendung eines GP-Fc-Fusionsproteins, wurden die so erzeugten Konstrukte erfolgreich zur Immunisierung und Induktion von mono-/ polyklonalen Antikörpern eingesetzt. Vier monoklonale Antikörper des Isotyps IgG gegen BoNT A1 und vier monoklonale Antikörper des Isotyps IgM gegen EboV Gp wurden in Bezug auf Detektionseigenschaften feincharakterisiert und z.T. zur Bildung von 14 autonomen Detektionspaaren eingesetzt. Das Repertoire der generierten Antikörper umfasste Antikörper mit Spezifität gegen die leichte und schwere Kette des BoNT A1, das Gp1 und Gp2 des EboV Gp, sowie zwei Antikörper mit Konformationsabhänigkeit der Epitope. Die Testung der generierten monoklonalen Reagenzien gegen BoNT zeigte eine effiziente Erkennung bis zu Nachweisgrenzen im Bereich von 8,5 - 25 pg BoNT A1/ ml und eine hochaffine Bindung nativen BT-Antigens. Die Überprüfung der Kreuzreaktivität ermittelte eine spezifische Detektion von nativen hochtoxischen BoNT-Komplexen der Toxinsubtypen A1-A3, aus clostridialen Kulturüberständen, durch drei der vier monoklonalen Detektionsantikörper. Zusätzlich konnten erfolgreich Versuchsreihen durchgeführt werden, um neuartige genetische Zytokinadjuvantien im aviären System zu testen und zu etablieren, was zu einer effizienten Steigerung der spezifischen IgY-Titer und der Gewinnung von reaktiven IgY- Präparationen im Gramm-Bereich führte.

Ein im Zuge der Arbeit entwickelter Selektionstest für filovirusreaktive Antikörper zeigte verlässliche Eigenschaften im Einsatz als diagnostischer Antikörpersuchtest. Das Verfahren bietet eine Grundlage für die Entwicklung neuartiger antikörperbasierter klinischer Filovirus-Nachweissysteme.


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