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Charakterisierungder Labyrinthopeptin-Synthetase LabKC in vitro

Müller, Wolfgang - Technische Universität Berlin (2011)


Der erstmals 1988 beschriebene Actinomyceten-Stamm Actinomadura namibiensis produziert in seinem Kulturüberstand die drei Sekundärmetabolite LabA1, A2 und A3. Dabei handelt es sich um ribosomal synthetisierte Peptide, welche aufgrund ihrer posttranslational eingeführten Lanthionin-Verbrückungen in die Gruppe der Lantibiotika eingeordnet wurden.

Die Aufklärung der Röntgenkristallstruktur von Labyrinthopeptin A2 erbrachte weitere detaillierte Einblicke in die bis dato noch relativ unbekannte Klasse III Lantibiotika. Eine zentrale Erkenntnis war vor allem die Entdeckung eines neuartigen Labionin-Motives. Mit der Identifizierung des Genclusters der Labyrinthopeptine wurde zudem der Grundstein für die weitere Untersuchung der Biosynthese gelegt. Neben den Sequenzen für die Vorläuferpeptide von LabA1 und LabA2 codieren weiterhin zwei Gene für den Export der Peptide, sowie ein Gen für ein Enzym LabKC, welches für die Einführung der Labionin-Verbrückungen verantwortlich ist.

Durch Vergleich mit anderen bekannten Enzymen konnten in der Sequenz von LabKC eine N-terminale Lyase- und eine zentrale Ser/Thr-Kinase-Domäne sowie eine C-terminale Domäne mit Ähnlichkeit zu Lantibiotika-Zyklasen identifiziert werden. Der vorgeschlagene Mechanismus für die Labionin-Bildung sieht zunächst die Phosphorylierung von zwei Serin-Resten im LabA2 Präpropeptid vor, gefolgt von der anschließenden Zyklisierung über ein C-terminales Cystein durch eine doppelte Michael-Addition.

Ausgehend von diesen Vorkenntnissen war das Hauptziel der vorliegenden Arbeit zunächst die Etablierung eines in vitro Enzym-Assays für die Untersuchung der Labyrinthopeptin-Biosynthese. Damit sollte eine detaillierte Charakterisierung der Funktionsweise des LabA2-prozessierenden Enzyms LabKC ermöglicht werden.

Hierzu wurde dieses zunächst erfolgreich kloniert, in E. coli exprimiert und gereinigt. Die Bereitstellung geeigneter Peptidsubstrate für die enzymatische Umsetzung erfolgte mittels chemischer Peptidsynthese an fester Phase. Nach Optimierung der Assay-Bedingungen sowie unter Verwendung des Nukleotids GTP als Co-Substrat für die Phosphorylierungsreaktion konnte schließlich die komplette Dehydratisierung und Zyklisierung eines synthetischen LabA2-Präpropeptids erreicht werden.

Für die Analytik der enzymatischen Umsetzungen wurden massenspektrometrische Methoden angewandt. Nach der Optimierung und Charakterisierung wichtiger Parameter für die in vitro Umsetzung mit LabKC stand die Untersuchung des katalytischen Mechanismus im Mittelpunkt der weiteren Arbeiten. Unter Anwendung von Mutagenese-Methoden konnten katalytisch wichtige Aminosäureseitenketten in der Lyase- und Ser/Thr-Kinase Domäne von LabKC identifiziert und ein entsprechender Mechanismus postuliert werden. Der Reaktionsablauf der Labyrinthopeptin-Biosynthese wurde zudem durch Umsetzungen synthetischer Labyrinthopeptin-Derivate mit LabKC untersucht.

Ein weiteres Ziel war die detaillierte Untersuchung der Rolle des Leaderpeptids für die Biosynthese der Labyrinthopeptine. Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch Testierung zahlreicher LabA2-Leaderpeptid-Varianten die absolute Notwendigkeit dieser Aminosäuresequenz für die erfolgreiche Prozessierung durch LabKC gezeigt werden. Weiterhin wurde ein Erkennungsmotiv identifiziert und charakterisiert. Im Fokus zukünftiger Arbeiten steht die Aufklärung des Mechanismus für die Labionin-Zyklisierung sowie die Strukturaufklärung von LabKC oder homologen Enzymen mittels Röntgenkristallographie.


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