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Vergleichende Untersuchungen zum molekularbiologischen Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) in Milch und Säuglingsanfangsnahrung

Molitor, Annalena - Justus-Liebig-Universität Gießen (2014)


Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Paratuberkulose bei Wiederkäuern. Aufgrund der typischen pathomorphologischen Veränderungen, die MAP in Rindern und Primaten auslöst, wurde ein möglicher Zusammenhang mit der Entwicklung von Morbus Crohn (MC) vermutet (Chiodini et al., 1989). Dieser wird seit Beginn des 20. Jahrhunderts immer wieder diskutiert. Die Wege, über die MAP zum Menschen gelangen kann, sind vielfältig. Das Überleben geringer Mengen MAP in Milch nach der Pasteurisierung konnte in zahlreichen Studien, unter anderem aus Deutschland (Hammer et al., 2002), gezeigt werden. Ist MAP im Ausgangsmaterial vorhanden, kann es aus dieser Milch hergestellte Produkte kontaminieren (Donaghy et al., 2004). Daher können neben Milch auch Milchprodukte wie Käse, Säuglingsnahrung und Sahne als mögliche Quelle für eine Übertragung von MAP auf den Menschen gesehen werden. Im Hinblick auf die erhöhte Empfänglichkeit von Kälbern für MAP (Windsor und Whittington, 2009) und der noch nicht geklärten Frage des zoonotischen Potentials, ist die Untersuchung von Säuglingsnahrung von besonderem Interesse. Die zuverlässige Diagnose einer Infektion mit MAP stellt das Hauptproblem in der Überwachung der Paratuberkulose dar. Die kulturelle Anzucht wird zwar als Goldstandard für den Nachweis von MAP beschrieben, aufgrund der kurzen Haltbarkeit von Milch und Milchprodukten und der langen Wachstumsdauer des Erregers ist diese unpraktisch für Routinediagnostik und Überwachung (Tasara und Stephan, 2005).

Ziel der eigenen Untersuchungen war es, ein Verfahren zur Erfassung von MAP-Zellen in Milch und Säuglingsanfangsnahrung als routinetaugliche Screeningmethode zur Verfügung zu stellen. Die in den eigenen Untersuchungen eingesetzte MAPsureEasy® (MSE) Real Time-PCR (Fa. TransMIT, Gießen) weist die MAP spezifische Zielsequenz f57 nach. Der Vorteil von f57 liegt in seiner strengen Einzigartigkeit (Herthnek und Bölske, 2006), Kreuzreaktionen konnten für f57 nicht nachgewiesen werden (Donaghy et al., 2011). Die DNA-Extraktion erfolgte mit jeweils modifizierten Protokollen für das High Pure PCR Template Preparation Kit (Fa. Roche, Mannheim) und das DNeasy® Blood & Tissue Kit (Fa. Qiagen, Hilden) sowie das automatisierte Maxwell® 16 System(Fa. Promega, Mannheim). Die Nachweisgrenze (Nachweiswahrscheinlichkeit 95%) für artifiziell kontaminierte Rohmilch lag für die einzelnen Verfahren im Bereich von 6,3x102 bis 7,9x102 KbE/10 ml. In Abhängigkeit von der verwendeten Methode lag die Nachweisgrenze bei Säuglingsanfangsnahrung "Pre" im Bereich von 4,1x100 bzw. 4,7x100 KbE/10 ml. In Säuglingsanfangsnahrung "One" lag die Nachweisgrenze bei 6,5x101 KbE/10 ml. Kombiniert mit der Real Time-PCR MAPsureEasy® liegt, unabhängig vom gewählten Extraktionsverfahren, das Endergebnis der molekularbiologischen Untersuchung innerhalb eines Arbeitstages vor. Somit kann die MAPsureEasy® Real Time-PCR als Schnellmethode zum Nachweis von MAP eingesetzt werden.

Im Anschluss an die Hauptversuche wurde ein repräsentatives Spektrum von Säuglingsanfangsnahrung ("Pre", "Pre HA" und "One") aus dem deutschen Handel molekularbiologisch auf das Vorkommen von MAP untersucht. In keinem der 24 untersuchten Produkte konnten MAP-DNA nachgewiesen werden.


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