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Produktion und Aufreinigung von Enzymen aus Essigsäurebakterien für biotechnologische Anwendungen

Meyer, Maria - Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn (2014)


Die Fähigkeit der Essigsäurebakterien, eine Vielzahl von Zuckern, Alkoholen und Polyolen unvollständig zu oxidieren wird in der Biotechnologie ausgenutzt. Eine Schlüsselrolle spielen dabei cytoplasmatische und vor allem membrangebundene Dehydrogenasen. In dieser Arbeit wurde ein Expressionssystem für die homologe Produktion und Aufreinigung von Proteinen aus Essigsäurebakterien weiterentwickelt, das die Charakterisierung von biotechnologisch relevanten Enzymen ermöglicht.

Die bereits in Gluconobacter (G.) oxydans etablierten Expressionsvektoren pBBR1p264 und pBBR1p452, mit einem starken bzw. moderaten konstitutiven Promotor, wurden durch die Integration der Sequenz für einen C-terminalen Strep-Tag optimiert. Das neu entwickelte Expressionssystem wurde zunächst anhand des cytoplasmatischen Proteins Gox1801 aus G. oxydans getestet. Das Enzym wurde unter Verwendung des Vektors mit dem starken Promotor homolog überproduziert und über Strep-Tactin-Affinitätschromatographie gereinigt. Das Enzym Gox1801 wurde als NAD(P)H-abghängige Succinat-Semialdehyd-Reduktase, die Succinat-Semialdehyd zu γ-Hydroxybutyrat umsetzt, identifiziert und genauer charakterisiert. Im nächsten Schritt wurde die durch das Gen gox0265 kodierte membrangebundene PQQ-abhängige Glukose-Dehydrogenase (mGDH) aus G. oxydans als Modell-Membranprotein eingesetzt. Die relative Expressionsrate des mgdh-Gens in dem Gluconobacter-Stamm, der den Überexpressionsvektor mit dem moderaten Promotor trug, war im Vergleich zum Kontrollstamm neunfach erhöht. Die Überproduktion der mGDH führte zu einer um 70 % gesteigerten Glukonatproduktionsrate. Die erhöhte Glukoseoxidationsrate könnte für die industrielle Produktion von Glukonaten und Ketoglukonaten sowie für die Anwendung in Biosensoren nützlich sein. Die mGDH-Aktivität und die Sauerstoffverbrauchsrate der Membranfraktionen des Überproduktionsstamms waren fünf- bzw. dreifach höher als die des Kontrollstamms.

Anders als im Kontrollstamm konnte die Sauerstoffverbrauchsrate der Membranfraktionen des mGDH-Überproduktionsstamms durch die Zugabe von Ethanol zusätzlich zu Glukose als Substrat nicht weiter gesteigert werden. Dies zeigte, dass die maximale Elektronentransportkapazität der Atmungskette erreicht wurde. Nach der Solubilisierung der Membranfraktionen mit Detergenz wurde die rekombinante mGDH in einem Schritt über Strep-Tactin-Affinitätschromatographie bis zur Homogenität aufgereinigt und im Anschluss charakterisiert. Durch den Einsatz einer doppelten Strep-Tag-Sequenz (One-Strep-Tag) wurde außerdem die Ausbeute bei der Aufreinigung des Membranproteins verbessert. Unter Verwendung des gleichen Systems wurde auch die PQQ-abhängige mambrangebundene Dehydrogenase Gox1857 homolog in G. oxydans überproduziert und aufgereinigt. Das Enzym wies eine geringe spezifische Aktivität mit dem Substrat myo-Inositol auf und zeigte keine Aktivität mit dem vermuteten Substrat L-Sorboson. Im letzten Schritt wurde das in dieser Arbeit optimierte und für G. oxydans etablierte System zur homologen Überproduktion und Aufreinigung von Proteinen für die Produktion der putativen L-Sorboson-Dehydrogenase Gdi_3764 aus Gluconacetobacter (Ga.) diazotrophicus eingesetzt. Die relative Transkriptionsrate des Gens gdi_3764 war in dem Überexpressionsstamm im Vergleich zum Ga. diazotrophicus-Wildtyp 8230-fach erhöht und das rekombinante Protein konnte über den One-Strep-Tag in geringen Mengen aufgereinigt werden. Die Übertragbarkeit des Expressionssystems auf Ga. diazotrophicus lieferte somit Hinweise darauf, dass die in dieser Arbeit eingesetzten Expressionsvektoren auch zur Genexpression in anderen Essigsäurebakterien geeignet sind.


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