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Methodische Entwicklung eines standardisierten Verfahrens zur quantitativen Proteomanalyse aus Formalin fixierten Geweben und dessen Einsatz in Protein Microarrays

Metzger, Volker - Technische Universität München (2010)


Proteomanalysen drängen derzeit in den Vordergrund, um Strukturen, Funktionen und Interaktionen von Proteinen und ihre Rolle in Krankheiten aufzuklären. Die Entdeckung neuer hoch sensibler und spezifischer Biomarker für eine frühzeitige Erkennung von Krankheiten, sowie die Entwicklung von personalisierten Therapieansätzen sind die zukünftigen Schlüsselfaktoren in der Behandlung von komplexen Krankeiten wie Krebs. Klinisches Archivmaterial stellt eine umfangreiche und wertvolle Quelle an Gewebeproben dar, zur Identifizierung von krankheitsassozierten Proteinmarkern. Aufgrund früherer Studien wurde angenommen, dass aus diesen Geweben keine Proteine isoliert werden können.

In der vorliegenden Arbeit konnte eine Methode etabliert werden, mit der nicht degradierte Proteine aus Formalin fixiertem Probenmaterial effizient extrahiert werden können. Die Proteindetektion erfolgte durch etablierte molekularbiologische Verfahren wie Western und Dot Blots. Die Extraktionsmethode konnte zudem so adaptiert werden, dass der Einsatz auf Reverse Phase Protein Microarrays möglich war. Protein Microarrays gehören zu einer aufstrebenden Klasse der Proteomanalyseverfahren, mit denen es möglich ist eine Vielzahl an Proben gleichzeitig zu detektieren und quantitative Analysen anzustellen. Die Vorteile neben der parallelen Prozessierung sind die hohe Sensitivität und die geringen Probenmengen, die benötigt werden. Die Methode ist daher sehr gut zur Untersuchung von Patientenbiopsien in der klinischen Routine geeignet. Es konnten Proteine aller Zellkompartimente (α-Tubulin, β-Actin, GAPDH, E-Cadherin, E-Cadherin Exon 9 Deletionsmutante, Histon H1) sowie posttranslational modifizierte Proteine (phospho-AMPKα) nachgewiesen werden. Die Spezifität der Antikörper wurde vor dem Einsatz in Reverse Phase Protein Microarrays mittels Western Blots überprüft.

Mit der dargestellten Methode können zuverlässig nicht degradierte Proteine aus Formalin fixierten und Paraffin eingebetteten klinischem Archivmaterial extrahiert werden und mit routinemäßigen, molekularbiologischen Methoden nachgewiesen werden. Fixierte und nicht fixierte Lysate verhalten sich in den Auswertungen weitestgehend vergleichbar. Der Proteomforschung eröffnen sich damit große und informationsvernetzte Probenbibliotheken aus klinischem Archivmaterial. Weiterhin konnte die Methode auf die Hochdurchsatzanwendung mit Reverse Phase Protein Microarrays ausgelegt werden. Sie eignet sich daher auch für den Einsatz in der klinischen Diagnostik und zur exakten Quantifizierung von Biomarkern aus entnommenen Gewebeproben. Die Methode stellt damit einen wichtigen Schritt in Richtung personalisierter Medzin dar und ergänzt sinnvoll die histopathologische Bewertung von Gewebeschnitten.


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