Unsere Seite auf

Dissertationen
Linksammlung durchsuchen

 

Eine MHz-Lichtquelle für die Femtosekunden-Stimulierte Raman-Mikroskopie

Marx, Philipp Benjamin - Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf (2013)


Die Schwingungsspektroskopie ist eine wichtige Methode zur Analyse von Molekülen, da anhand des Schwingungsspektrums eines Moleküls wichtige Aussagen über dessen Struktur getroffen werden können. Die IR-Absorptionsspektroskopie und die Ramanspektroskopie sind die zwei bedeutsamsten Techniken, um Schwingungsspektren aufzunehmen. Beide Techniken eignen sich zur Gewinnung von Schwingungsspektren mikroskopischer Proben. Damit können diese nicht nur morphologisch charakterisiert werden wie in der konventionellen Lichtmikroskopie, sondern auch anhand ihrer molekularen Zusammensetzung. Die Ramanmikroskopie besitzt eine höhere räumliche Auflösung als die IR-Mikroskopie, aber eine geringere Signalstärke als diese. Deswegen wurden optisch nichtlineare Techniken wie die kohärente anti-Stokes Ramanstreuung (CARS) und die stimulierte Ramanstreuung (SRS) zur Signalverstärkung in der Ramanmikroskopie angewandt. Die Femtosekunden-stimulierte Ramanspektroskopie (FSRS) ermöglicht die spektral breitbandige Aufnahme von (stimulierten) Ramanspektren. Man benötigt für die FSRS zwei Lichtimpulse: Einen spektral breitbandigen Impuls als "Ramanprobeimpuls" und einen spektral schmalbandigen und intensiven Impuls als "Ramanpumpimpuls". Diese Technik wurde 2007 von Ploetz et al. erstmals in der Mikroskopie als Kontrastmechanismus eingesetzt und in Anlehung an die FSRS Femtosekunden-stimulierte Raman-Mikroskopie (FSRM) genannt. Die verwendeten Lichtimpulse wurden von einem Ti:Sa-Laser/Verstärkersystem mit einer Wiederholrate von 1 kHz abgezweigt und entsprechend den jeweiligen Erfordernissen für Ramanpump bzw. -probeimpuls angepasst. Der verwendete Ramanpumpimpuls aus diesem Lasersystem besaß eine Energie im Bereich von einigen 100 nJ. Wenn diese Energie mit Hilfe eines Mikroskopobjektives fokusiert wird, ergibt sich im Fokus eine Spitzenleistung, die unverträglich mit biologischen Proben ist.

Deswegen wurde eine neue Lichtquelle konzipiert, die auf einem Ti:Sa-Oszillator mit einer Wiederholrate von 75 MHz beruht und eine entsprechend niedrigere Impulsenergie aufweist. Die Kernidee dieses Konzeptes ist, dass der Ramanprobeimpuls ohne weitere Konversion direkt im Laseroszillator erzeugt wird und dann der Ramanpumpimpuls aus dem Flügel des Oszillatorspektrums verstärkt wird. Dieses Konzept wurde im Zuge dieser Arbeit realisiert: Es wurde ein Ti:Sa-Oszillator mit einem sehr breitem Spektrum beschafft und eine Faserverstärker aufgebaut, um den Ramanpumpimpuls zu erzeugen. Der Faserverstärker benutzt Yb3+-dotierte Fasern als aktives Medium. Die erzeugten Impulse wurden zeitlich und spektral charakterisiert. Die spektrale Breite des Ramanprobeimpulses betrug ca. 1875 cm-1. Der Ramanpumpimpuls besaß eine Energie von ca. 0.5 nJ, er war 1.2 ps lang und das Spektrum war 18 cm-1 breit. Mit Hilfe dieser Lichtimpulse gelang es stimulierte Ramanspektren von Reinsubstanzen aufzunehmen. Der abgebildete Spektralbereich des Schwingungsspektrums reichte von 900-4000 cm-1. Die spektrale Auflösung betrug ca. 20 cm-1.

Dabei wurde eine neue Messmethodik, das sogenannte "Phasestepping", auf die FSRM angewandt. Diese ermöglichte die Verwendung eines Detektors mit "Rolling-Shutter" ohne systematischen Fehler. Die Ramanbandenhöhen des stimulierten Ramanspektrums von Benzonitril wurden mit den Bandenhöhen des spontanen Ramanspektrums von Benzonitril verglichen und eine systematische Abweichung festgestellt.

Um diese Lichtquelle für die FSRM nutzbar zu machen, wurde ein rasterndes Mikroskop aufgebaut. Zunächst wurden mit diesem Mikroskopiestandards aus unterschiedlichen Polymeren abgebildet. Mit Hilfe einer Hauptwertanalyse gelang es die verschiedenen Polymere zu unterscheiden. Daraufhin wurde auch eine menschliche Epithelzelle abgebildet. Die Ramanspektren dieser Abbildung wurden anhand des Ramansignals einer einzelnen Ramanbande ausgewertet und dargestellt.

Das Rauschen bei der Messung von Ramanspektren wurde ausführlich analysiert. Dieses setzte sich aus dem Schrotrauschen durch die Photonen des Ramanprobeimpulses und dem Laseramplitudenrauschen zusammen. Das Signal-zu-Rauschverhältnis eines mit dem Aufbau aufgenommen Ramanspektrums genügt im derzeitigen Zustand nicht, um anhand des "Fingerprint"-Bereichs des Spektrums Zellkompartimente zu differenzieren. Eine höhere Detektionsrate könnte sowohl den Beitrag des Schrotrauschens als auch den des Amplitudenrauschens zum Gesamtrauschen senken. Ein optimierter Pumpimpuls, ein Detektor mit höherer Ausleserate und bessere Datenaufbereitung werden den Weg zur Bildgebung an biologischen Proben mit der FSRM ebnen.


—> Volltext

Abonnieren:

Empfehlen: