Identifizierung, Bereitstellung und Charakterisierung von Pseudomonas Lipasen zur kinetischen Racemattrennung von α-Hydroxyketonen
Maraite, Andy - Technische Universität Berlin (2011)
Im Feinchemiesektor sowie in der pharmazeutischen Industrie stellen chirale α-Hydroxyketone wertvolle Grundbausteine dar. Daher wurden eine Reihe chemischer asymmetrischer Synthesen entwickelt, die jedoch allesamt ziemlich ineffizient sind, da aufgrund mehrerer Syntheseschritte unerwünschte Nebenprodukte und eine geringe Gesamtausbeute anfallen. Zudem ist die Enantiomerenreinheit eher gering.
So wurden verschiedene biokatalytische Strategien entwickelt, da Enzyme aufgrund ihrer hohen Chemo-, Regio- und Enantioselektivitäten die Probleme der rein chemischen Synthese umgehen können. Zudem sind sie auch bei milden Reaktionsbedingungen einsetzbar.
Als industriell wichtigste Methode zur Gewinnung enantiomerenreiner α-Hydroxyketone hat sich die kinetische Racemattrennung durch Hydrolasen durchgesetzt, da diese Enzyme keine Cofaktoren benötigen und sich als relativ stabil und aktiv in organischen Lösungsmitteln erwiesen haben. So katalysiert die Lipase TL aus Pseudomonas stutzeri die kinetische Racemattrennung von Benzoin als Modellsubstrat für α-Hydroxyketone. Die eingesetzte Lipase ist ein kommerzielles Präparat, über dessen Natur bisher sehr wenig bekannt ist. Ziel der Arbeit war die Identifikation der Lipase TL mit anschließender Expression, Aufreinigung und biochemischer Charakterisierung. Zudem sollte die Fähigkeit des rekombinanten Enzyms zur kinetischen Racemattrennung von α-Hydroxyketonen untersucht werden.
Die Aminosäuresequenz und Struktur der Lipase, LipC genannt, konnten aufgeklärt werden. Zudem wurde eine hohe Homologie zur LipA aus P. aeruginosa festgestellt. Des Weiteren wurde das P. stutzeri Genom auf weitere Lipasen der gleichen Größenordnung untersucht. Dabei wurde die Lipase LipD entdeckt, die eine hohe Homologie gegenüber der P. mendocina Lipase 2FX5 (PDB) aufweist. Modellierungsversuche am aktiven Zentrum durch unseren Kooperationspartner in Madrid ergaben, dass theoretisch sowohl die LipC als auch die LipD in der Lage sein sollten, die KR von α-Hydroxyketonen zu katalysieren.
Beide Enzyme wurden rekombinant in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Die LipC benötigte zur korrekten Faltung ein spezifisches Chaperon (LipH), das zusammen mit der LipC co-exprimiert wurde. Die LipA aus P. aeruginosa wurde bisher nur als natives Enzym aus dem Wildtypstamm isoliert. Die Arbeitsgruppe Rosenau-Jaeger hat ein rekombinantes Expressionssystem in E. coli für die LipA entwickelt und zur Verfügung gestellt. Somit konnten die rekombinanten Enzyme LipA, LipC und LipD biochemisch charakterisiert und auf die Fähigkeit zur kinetischen Racemattrennung von α-Hydroxyketonen untersucht werden.
Die Enzyme LipA und LipC waren in der Lage die KR von Benzoin zu katalysieren, allerdings mit einer geringeren Aktivität gegenüber der Lipase TL. Grund der Aktivitätsunterschiede liegt vermutlich in der mangelhaften Disulfidbrückenbindung der Lipasen während der heterologen cytoplasmatischen Expression in E. coli. Die LipD war nicht in der Lage, die KR von Benzoin zu katalysieren, allerdings konnte α-Methylbenzylbutyrat umgesetzt werden. Somit konnte gezeigt werden, dass ein aromatischer Ligand am sekundären Alkohol nicht den limitierenden Faktor darstellt, sondern viel mehr die Benzoylgruppe der α-Hydroxyketone.