Charakterisierung der Glykosylierungsstelle von Glykoproteinen mittels Matrix-unterstützter Laserdesorption / Ionisations- (MALDI) und Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS)
Liu, Xi - Charité Berlin (2015)
Die Glykosylierung ist eine wichtige posttranslationale Modifikation, die die biologische Aktivität von Proteinen wesentlich beeinflusst. Sie ist ortsspezifisch und abhängig von der sterischen Hinderung um die Glykosylierungsstellen und den vorhandenen Glycosyltransferasen.
Humanes Alpha-1-Antitrypsin (A1AT) ist ein bekanntes Glykoprotein mit Antiprotease-Aktivität. Das Protein A1AT besitzt 394 Aminosäuren und drei potentielle N-Glykosylierungsstellen an den Positionen Asn-46, Asn-83 und Asn-247. Ein A1AT-Mangel wird zur Zeit mit humanem A1AT aus dem Plasma behandelt. In Hinblick auf die therapeutischen Anwendungen wurde rA1AT in der neuen humanen neuronalen Zelllinie (AGE1.hn) und der human embryonic kidney 293 (HEK293) Zelllinie hergestellt. In der vorliegenden Arbeit wurden die N-Glykosylierung und die Glykosylierungsstelle von A1AT aus AGE1.hn-Zellen und HEK293-Zellen sowie von den entsprechenden A1AT-Varianten aus HEK293-Zellen massenspektrometrisch analysiert.
Die Glykopeptide wurden mit der zwitterionischen hydrophilen Interaktionsflüssigkeitschromatographie (ZIC-HILIC) angereichert und mittels nano-RPLC-MS/MS analysiert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass A1AT aus der AGE1.hn Zelllinie Asn-247 größtenteils biantennäre fucosylierte N-Glykane besitzt, während die Glykosylierungsstelle Asn-46 triantennäre Glykane trägt. Asn-83 besitzt überwiegend fucosylierte tri- und tetraantennäre Glykane. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die verwendeten Zelllinien (AGE1.hn und HEK293) zur Produktion der A1AT einen entscheidenden Einfluss auf die Kohlenhydratseitenketten des Glykoproteins haben.
Die neuen A1AT-Varianten N123 und N201 aus der HEK293-Zelllinie wurden mit einzelnen zusätzlichen N-Glykosylierungsstellen hergestellt. Das ortsspezifische Profil der A1AT-Variante N123 bestand vor allem aus monofucosylierten bi-, tri- und tetraantennären komplexen N-Glykanen mit einer Tendenz zu höheren Antennen-Strukturen im Vergleich zum Wildtyp. An der Glykosylierungsstelle N201 sind ausschließlich tetraantennäre Strukturen vorhanden.
Humanes GM-CSF stimuliert hauptsächlich Granulozyten- und Makrophagenvorläuferzellen und ist an der Regulation der Hämatopoese sowie an Immun- und Entzündungsreaktionen beteiligt. Es wird als Medikament bei Krebspatienten verwendet, um Granulozytopenie, eine Nebenwirkung der Chemotherapie zu vermeiden. GM-CSF ist ein Fusionsprotein, das in HEK293-Zellen exprimiert wurde. Es wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit eine detaillierte Strukturanalyse der N- und O-Glykane dieses Proteins dargelegt. Bei den N-Glykanen konnten ca. 60 verschiedene Kohlenhydratkompositionen, vor allem Oligosaccharide vom komplexen Typ mit mehrfach Fucose und/oder Sialinsäuren, nachgewiesen werden. In Proben dominierten sialylierte O-Glykane.