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Dynamische Kernpolarisation in der Festkörper-Magnetresonanzspektroskopie von Proteinen

Linden, Arne Helge - Freie Universität Berlin (2013)


Die Strukturaufklärung von Proteinkomplexen oder von Membranproteinen mittels Magnetresonanzspektroskopie (NMR) ist vor allem durch die geringe Sensitivität dieser Methode limitiert. Die dynamische Kernpolarisation (DNP) kann die Intensität von NMR-Signalen um bis zu zwei Größenordnungen steigern, indem die relativ große Polarisation von ungepaarten Elektronen unter Mikrowellenanregung und bei kryogenen Temperaturen auf Kerne übertragen wird. Erfahrungen, DNP bei Proteinen anzuwenden, sind jedoch kaum vorhanden.

In dieser Arbeit wird der Einfluss der einzelnen experimentellen Parameter untersucht und optimiert, mit dem Ziel auswertbare DNP-Spektren von Proteinen zu erhalten.

In ersten Untersuchungen zeigte sich, dass Proteinsignale bei kryogenen Temperaturen eine starke Linienverbreiterung zeigen. Um die zugrundeliegenden Prozesse zu verstehen, wurden 2D Spektren des Proteins SH3 bei Temperaturen zwischen 295 und 95K aufgenommen und im Detail analysiert. Es zeigte sich, dass die Linienverbreiterung vor allem inhomogen ist. Das Ausmaß der Verbreiterung hängt dabei stark von der jeweiligen Seitenkette und ihrer individuellen Umgebung ab.

Neben den kryogenen Temperaturen unterscheidet vor allem die Zugabe von Radikalen die DNP von konventioneller NMR. Die genutzten Biradikale verändern als Paramagneten die NMR-Parameter von Kernen in ihrer Nähe. Eine genaue Untersuchung und Quantifizierung dieser Effekte wurde mit gefrorenen Lösungen von Prolin durchgeführt. Die Radikale verkürzen die Relaxationszeiten der benachbarten Kerne. Eine schnellere T1-Relaxation der Protonen erlaubt dabei eine kürzere Messzeit, während eine schnellere T2-Relaxation der Kohlenstoffe deren NMR-Signale homogen verbreitert. In Summe führen die paramagnetischen Effekte dazu, dass Kerne in einem Abstand bis zu ungefähr 10 Angström um ein radikalisches Zentrum in der NMR nicht detektierbar sind und die optimale Konzentration an Radikalen für jede Probe unterschiedlich ist.

Aufgrund der inhomogenen Signalverbreiterung bei kryogenen Temperaturen stellt sich die Frage, ob DNP-Experimente auch bei intermediären Temperaturen durchgeführt werden können, ohne die DNP-Verstärkung vollständig zu verlieren. Dazu wurden DNP-Messungen von deuteriertem SH3 bei 173K durchgeführt. Dabei beträgt der Verstärkungsfaktor der Protonen noch ca. 11 und die Auflösung der Spektren ist wesentlich besser als bei 95K. Diese Methode hat für Proben, die deuteriert werden können, in Zukunft ein großes Potenzial.

Um zu untersuchen, wie sich Membranproteine mittels DNP messen lassen, wurde als Testsystem Neurotoxin II gebunden an nikotinerge Acetylcholinrezeptoren in nativen Membranen gewählt. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich das Biradikal bevorzugt an Protein- und Membranoberflächen anlagert, wodurch die NMR-Signale des Liganden stark homogen verbreitert sind. Außerdem reagiert das Biradikal mit Probenbestandteilen und wird inaktiviert. Durch eine Lagerung bei 20 °C lässt sich dieser Effekt ausnutzen, um nur die Radikale nahe des Analyten zu inaktivieren, während im gefrorenen Lösungsmittel aktive Radikale verbleiben. Unter diesen Umständen lassen sich DNP-Signale mit einer Auflösung wie bei Rautemperatur-Messungen erhalten. So kann ohne Informationsverlust die Messzeit von zehn Tagen auf zehn Stunden reduziert werden.

Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, wie sich DNP-Parameter und Proben optimieren lassen, um die DNP-Spektroskopie für eine Anwendung an Proteinen weiterzuentwickeln. Zwei verschiedene Wege wurden aufgezeigt, die es erlauben, aufgelöste und DNP-verstärkte Spektren von Proteinen zu messen und in Zukunft neue strukturbiologische Antworten zu finden.


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