Etablierung eines Verfahrens zur Kombination der Elektronenmikroskopie (EM) mit der Spitzenverstärkten Raman-Spektroskopie (TERS) sowie Untersuchungen zum Infektionsprozess und der Ultrastruktur des Humanen Endogenen Retrovirus K (HERV-K)
Lausch, Veronika - Freie Universität Berlin (2013)
Im Hinblick auf die Gefahren von bioterroristischen Angriffen ist es wichtig schnell und auch spezifisch Pathogene im Probenmaterial potentieller Fälle zu identifizieren. Die EM mit ihrer hohen Ortsauflösung und dem breiten diagnostischen Spektrum ist dafür eine sehr gute Methode. Um auf Einzelpartikelniveau zwischen nah verwandten und im EM identischen Erregern zu unterscheiden, wurden im Rahmen dieser Arbeit eine Methode evaluiert, welche eine korrelative Kopplung der TEM mit der TERS erlaubt. In diesem Zusammenhang wurden Schwermetallsalze zur Kontrastierung und weitere Materialien auf ihre Eignung für die korrelative TEM-TERS Technologie getestet. Dabei erwies sich PTA als das am besten geeignete Kontrastmittel. Weiterhin wurden drei verschiedene auf Silizium-basierende Grids (Si-Grids) auf ihre Verwendung im TEM und TERS untersucht. Hierbei erfüllte ein mit Siliziumnitrid beschichtetes Grid (SiN-Grid) die Voraussetzungen, wie Elektronentransparenz, hohe Partikeladsorption und Hitzestabilität, am besten.
In Optimierungsversuchen wurde die Partikeladhäsion der Grids gesteigert und erste TERS-Spektren von einzelnen Pocken aufgenommen, die vorher im EM visualisiert wurden. Aufgrund der geringen Partikelstabilität konnten keine Spektren von Retroviren aufgenommen werden. Es gelang jedoch die komplette Rekonstitution eines HERV-K(HML-2) Elements sowie dessen Expression und Darstellung der Virionen in EM-Schnittpräparaten. Trotz vollständiger Rekonstitution ist das Virus nicht in der Lage in humanen und tierischen Zellen zu replizieren. Als eine mögliche Ursache konnte ein Block im Replikationszyklus nach Viruseintritt und vor der Proteinexpression gemessen werden. Dieser Block kann durch die Zugabe von Kompetition-Viren abgesättigt werden. Als einer der inhibierenden Faktoren konnte Trim5α identifiziert werden. Die Identifizierung und Analyse dieser Inhibitoren ist für das Verständnis der Biologie endogener sowie exogener Retroviren von großer Bedeutung und könnte ebenfalls helfen die Beobachtung der HERV-K-Expression in verschiedenen humanen Tumoren besser zu verstehen.