Charakterisierung von Nanopartikel-Protein-Agglomeraten in biologisch relevanten Medien
Lang, Thomas - Technische Universität Berlin (2014)
In der vorliegenden Forschungsarbeit wurden drei unterschiedliche Nanomaterialien untersucht, welche unter physiologischen Bedingungen ein unterschiedliches Verhalten aufwiesen. Bei diesen Materialien handelte es sich um stabilisatorfreie Legierungs-Nanopartikel aus der Laser-Ablation, amorphe Silica- sowie um Poly(organosiloxan) Nanopartikel. Im Hinblick auf in vitro Zellstudien wurde eine Größencharakterisierung in Zellmedium in Gegenwart von Proteinen aus fötalem Rinderserum durchgeführt. Um Vorteile einzelner Charakterisierungsmethoden zu kombinieren und gleichzeitig Nachteile zu kompensieren, wurden zur umfangreichen Charakterisierung die Statische Lichtstreuung, die Dynamische Lichtstreuung sowie die Asymmetrische Fluss Feld-Fluss Fraktionierung angewandt. Weiterhin wurde die Asymmetrische Fluss Feld-Fluss Fraktionierung mit einem online MALLS Detektor gekoppelt. Es handelt sich hierbei um einen Prototyp, bei dem durch einen hydrodynamisch fokussierten Probestrahl eine Minimierung des Probevolumens erfolgt.
Die Legierungs-Nanopartikel wiesen unter physiologischen Salzbedingungen eine nur unzureichende elektrostatische Stabilität auf, zeigten jedoch höhere Stabilität in Gegenwart von Serumproteinen. Im Gegensatz hierzu waren amorphe Silica Nanopartikel unter hohen Salzkonzentrationen stabil, aggregierten jedoch in Gegenwart von Proteinen. Das Agglomerationsverhalten der amorphen Silica Nanopartikel wurde genauer untersucht, indem hierauf ein in dieser Arbeit hergeleitetes Modell der Wachstumsfunktionen von Teilchen-Cluster- und Cluster-Cluster-Aggregaten angewandt wurde. Poly(organosiloxan) Nanopartikel wiesen in Gegenwart von Serumproteinen keine Aggregate auf. Anhand dieser Probe wurde die Dicke der Proteinkorona durch ein statisches Lichtstreuexperiment bestimmt, welches einen alternativen Zugang zu bereits etablierten Methoden wie der Dynamischen Lichtstreuung, der Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie oder dem Particle Tracking darstellt.
Als Ergebnis konnte für die Koagulation amorpher Silica Nanopartikel in Gegenwart von Serumproteinen der Mechanismus der verbrückenden Flockung nachgewiesen werden. Der Flockungsprozess war nach 10 Minuten abgeschlossen. Weiterhin war die Anzahl der gebildeten Brücken unabhängig von der vorhandenen Partikelzahl konstant, jedoch bestimmte die Größe der ursprünglichen Nanopartikel die absolute Anzahl der gebildeten Verbrückungen. Amorphe Silica Nanopartikel mit einem Radius von 10 und 15 nm wurden mit einem Faktor von 40 effizienter verbrückt als Partikel mit einem Radius von 60 nm. Die Anzahl der Proteine pro Verbrückung sowie ein größerer sterisch unzugänglicher Bereich nahe der Verbrückungsstelle sind für die geringere Verbrückungseffizienz großer Teilchenspezies verantwortlich. Die Proteinkorona auf Poly(organosiloxan) Nanopartikeln wurde auf eine Dicke von 1,5 nm bestimmt. Diese verkleinerte sich durch PEGylierung des Nanomaterials auf eine Dicke von 0,4 nm. Diese Funde wurden mittels Asymmetrischer Fluss Feld-Fluss Fraktionierung bestätigt. Unter der Annahme starrer Proteine entsprechen diese Werte einer Oberflächenbedeckung von 48% bzw. 12%. Im Falle der nicht-PEGylierten Probe wurde die scheinbar unvollständige Oberflächenbelegung aufgrund der Entfaltung der Proteine auf kolloidalen Oberflächen erhalten. Zusätzlich entstehen bei statistischer Verteilung adsorbierter Proteine keine Dichtestpackungen, sondern sterisch unzugängliche Bereiche auf der Nanopartikel Oberfläche, wodurch die maximale Oberflächenbelegung nicht 100% entspricht.