Proteomische Methoden zur Identifizierung acetylierungsabhängiger Interaktionspartner von Histon H4
Lang, Diana - Technische Universität Berlin (2012)
Die systematische Analyse von Protein-Protein-Interaktionen ist eine wichtige Voraussetzung für die Aufklärung molekularer Zusammenhänge und biologischer Funktionen innerhalb einer Zelle. Für die proteomweite Identifizierung interagierender Proteine haben sich in den letzten Jahren vermehrt Methoden durchgesetzt, die auf Affinitäts-Pulldown-Experimenten in Kombination mit quantitativer Massenspektrometrie basieren (Affinitäts-MS-Experiment).
In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Ansatz, bestehend aus einer Kombination von mehrdimensionaler Peptidauftrennung mittels Flüssigchromatographie und hochaufgelöster Tandem-Massenspektrometrie, zur effektiven Identifizierung und Quantifizierung komplexer Proteingemische aus Affinitäts-Pulldown-Experimenten entwickelt. Die Methode beruht auf der Verwendung von Umkehrphasenchromatographie (RP) mit pH-sauren Elutionsbedingungen in beiden chromatographischen Dimensionen und führt durch Anwendung eines spezifischen Fraktionierungsschemas in der ersten Dimension zu einer optimalen Trenn- und somit MS/MS-Kapazität in der zweiten Dimension. Die Entwicklung und Validierung der Methodik erfolgte zunächst durch proteomweite Interaktionsanalysen mit gut charakterisierten, Tyrosin 595-phosphorylierten, Peptiden des T-Zelladapterproteins ADAP. In Kombination mit verschiedenen Isotopenmarkierungsverfahren (SILAC, enzymatische 18O-Markierung) konnten unter Anwendung der entwickelten 2-D RP-RP LC-MS/MS Methodik phosphorylierungsspezifische Interaktionspartner der ADAP-595-Peptidsequenz identifiziert werden.
Im weiteren Verlauf wurde die 2-D RP-RP LC-MS/MS Methodik für die proteomweite Analyse von Interaktionspartnern des Zellkernproteins Histon H4 angewandt. Da Lysinacetylierungen generell mit einer Genaktivierung assoziiert sind, sollte insbesondere die Rolle dieser Modifizierungen als potentielle Erkennungsmotive bzw. als Werkzeug der Ladungsneutralisierung untersucht werden. Dazu wurden verschiedene acetylierte Peptide der N-terminalen Histon H4-Sequenz synthetisiert und als Matrix-gebundene Köder in differenziellen, SILAC-basierten Peptid-Pulldown-Experimenten eingesetzt. Dabei konnten additive Effekte der Histonacetylierung auf das Bindungsverhalten beobachtet werden, d.h. mit zunehmender Anzahl der Lysinacetylierungen erhöhte sich auch die Anzahl der Proteine, die nicht mehr mit dem Peptid interagierten. Darüber hinaus wurden potentielle, acetylierungsabhängige Interaktionspartner mehrfach acetylierter H4-Peptide identifiziert, wobei die Mehrzahl bekannte Chromatin- sowie RNA-Polymerase II-Interaktoren darstellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Peptid-basierte Affinitäts-MS Experimente einen wertvollen Beitrag zum Verständnis von Protein-Protein-Interaktionen leisten können.