Virtuelles und NMR basiertes Screening zur Ermittlung neuer Liganden für das H-Ras-Protein sowie Charakterisierung der Ligand-Protein-Wechselwirkungen mittels (1H-15N)-sofast-HMQC-Spektroskopie
Kreitner, Sandra - Universität Regensburg (2011)
Ziel dieser Arbeit war es, durch virtuelle und STD-NMR basierte Screenings neue Liganden für aktives Ras in Zustand 1 zu identifizieren. Dazu sollte sowohl das virtuelle als auch das in Teilen automatisierte STD-NMR-Screening zunächst am Lehrstuhl für Biophysik etabliert werden. Für den ersten Schritt, das virtuelle Screening mit dem Programm LUDI, war zunächst die Erstellung geeigneter, virtueller 3D Strukturdatenbanken und die Modifizierung der 3D Proteinstruktur von c'Ras(T35A)•Mg2+•GppNHp nötig. Bei dem virtuellen Screening waren zwei Ansätze interessant. Zum einen das Screening direkt im aktiven Zentrum, an gleicher Position neben dem P des Nukleotids wo auch Zn2+-Cyclen bindet, und zum andern an definierten Positionen nahe des aktiven Zentrums um eine spätere Verlinkung zu ermöglichen. Nach Ermittlung virtueller Liganden wurden diese auf reale Bindung am Ras-Protein mittels STD-NMR überprüft. Ein reales Screening von 500 Substanzen der Maybridge RO3 Fragment Library an c'Ras(T35A)•Mg2+•GppNHp mittels STD-NMR identifizierte weitere neue Liganden für aktives Ras in Zustand 1.
Die entsprechenden Bindungspositionen und Bindungskonstanten von den neuen Liganden wurden dann durch Molecular Modeling mit LUDI und (1H-15N)-sofast- HMQC-Titrationen ermittelt. Ob diese Liganden in der Lage sind, das konformationelle Gleichgewicht in Ras(wt) hinzu Zustand 1 zu verschieben, wurde daraufhin mittels 31P-NMR überprüft.
Eine weitere Aufgabe stellte die Expression, Aufreinigung und Charakterisierung einer neuen Mutante von Ras, c'Ras(T35A, H166A), dar. Diese Mutante wurde mit c'Ras(T35A)•Mg2+•GppNHp hinsichtlich ihrer 2D Spektren und der Bindung von Zn2+-Cyclen und Zn2+-BPA verglichen.